【摘 要】
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近年来,越来越多的miRNA分子被证实具有调控肿瘤发生发展的能力,但miRNA分子应用于临床肿瘤治疗仍受限制于核酸药物分子给药系统的不完整以及miRNA分子对肿瘤细胞的调控机制尚未完全明确。为了拓宽核酸药物分子给药途径,探讨miRNA分子应用于肿瘤治疗的可能性,本课题设计合成cRGD-R9-SS-R9多肽段,包裹miR-16得到纳米粒分子,考察该纳米粒体外生物学功能,验证其抑制卵巢癌细胞生长及增强
【基金项目】
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国家自然科学基金（81773641）； 广州市科技计划项目（201604020167）；
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近年来,越来越多的miRNA分子被证实具有调控肿瘤发生发展的能力,但miRNA分子应用于临床肿瘤治疗仍受限制于核酸药物分子给药系统的不完整以及miRNA分子对肿瘤细胞的调控机制尚未完全明确。为了拓宽核酸药物分子给药途径,探讨miRNA分子应用于肿瘤治疗的可能性,本课题设计合成cRGD-R9-SS-R9多肽段,包裹miR-16得到纳米粒分子,考察该纳米粒体外生物学功能,验证其抑制卵巢癌细胞生长及增强顺铂敏感性的作用效果与作用机制,探讨该肿瘤靶向纳米给药系统的应用可能。方法1.确定miRNA分子研究对象,合成多肽及纳米粒分子查阅文献并利用流式细胞术筛选与验证获得具有促卵巢癌细胞SK-OV-3细胞凋亡且增强其顺铂敏感性的miRNA分子。合成R9-SS-R9及cRGD-R9-SS-R9多肽段,并使用高效液相色谱与质谱法进行结构鉴定与纯度检测。利用多肽段按5:1、10:1、20:1、40:1的多肽/miRNA重量比包裹miRNA合成纳米粒。2.纳米粒分子的表征利用琼脂糖凝胶电泳技术以及马尔文仪器、透射电镜完成纳米粒粒径、分散指数、电位、形态以及稳定性的表征,确定最适多肽/miRNA重量比。利用CCK-8法完成纳米粒材料的细胞毒性实验。3.纳米粒的效率验证（1）纳米粒摄取效率:在SK-OV-3细胞中转染200nM、400nM的R9-SS-R9/siNC-cy5、cRGD-R9-SS-R9/siNC-cy5 纳米粒以及 siNC-cy5,利用流式细胞术检测细胞对纳米粒的摄取。（2）在RNA水平验证转染效率:利用茎环qRT-PCR技术检测转染R9-SS-R9/miRNA、cRGD-R9-SS-R9/miRNA纳米粒后细胞内miRNA的相对表达量。（3）纳米粒在细胞内的分布:利用共聚焦高内涵成像系统拍摄R9-SS-R9/siNC-cy5、cRGD-R9-SS-R9/siNC-cy5纳米粒与细胞溶酶体的共定位图,观察纳米粒是否逃离内体循环途径。4.体外评价纳米粒对卵巢癌细胞的促凋亡与增强顺铂敏感性作用（1）纳米粒对细胞促凋亡作用:在细胞内转染R9-SS-R9/miRNA、cRGD-R9-SS-R9/miRNA纳米粒,并设置顺铂添加组,利用流式细胞术检测细胞凋亡情况。（2）在蛋白水平研究影响细胞凋亡与细胞顺铂敏感性的机制:在细胞内转染R9-SS-R9/miRNA、cRGD-R9-SS-R9/miRNA 纳米粒,利用 western blot 技术检验细胞内Bcl-2与Chk-1蛋白的表达变化。结果1.选定miR-16分子作为研究对象。成功合成cRGD-R9-SS-R9多肽并以多肽:miRNA为5:1的重量配比包裹miR-16形成形态良好、结构稳定的纳米粒。2.采用CCK-8法验证得出cRGD-R9-SS-R9多肽毒性较低。3.纳米粒的效率验证（1）利用流式细胞术验证cRGD-R9-SS-R9/siNC-cy5纳米粒的摄取量高于对照组。（2）通过茎环 RT-qPCR 技术验证 SK-OV-3 细胞转染 cRGD-R9-SS-R9/miR-16纳米粒后miR-16的表达量显著高于cRGD-R9-SS-R9/siNC纳米粒（p<0.01）。（3）利用共聚焦高内涵成像系统验证cRGD-R9-SS-R9./miR-16纳米粒可被SK-OV-3细胞良好摄取,并分布在细胞质中。4.体外评价纳米粒对卵巢癌细胞的抗增殖与增强顺铂敏感作用（1）cRGD-R9-SS-R9/miR-16纳米粒对SK-OV-3细胞的促凋亡作用显著高于对照组（p<0.01）,cRGD-R9-SS-R9/miR-16纳米粒联用顺铂后提高的凋亡率显著高于对照组联用顺铂（p<0.0001）。（2）采用western blot实验在蛋白水平上验证实验组细胞中Bcl-2、Chk-1蛋白水平表达低于对照组（p<0.01）。结论cRGD-R9-SS-R9多肽包裹miR-1 6形成的纳米粒结构稳定、细胞毒性低,实现了 miR-16的肿瘤靶向,增强了 miR-16的细胞摄取与内体逃逸。该肿瘤靶向纳米递释系统通过减少Bcl-2、Chk-1基因的表达,促进了 SK-OV-3细胞的凋亡并增加细胞对顺铂的敏感性,为miR-16体内应用奠定了基础。
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