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第一部分糖尿病和缺血/再灌注后心肌时钟基因振荡和HDAC3表达情况目的通过建立1型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury,I/RI）模型,探讨不同病理生理条件下,心肌损伤的程度以及对时钟基因振荡和HDAC3表达的影响。方法采用SPF级健康成年雄性SD大鼠为实验对象,腹腔注射链脲霉素（streptozocin,STZ）60mg/kg制备1型糖尿病模型,72小时后血糖≥16.7mmol/L为模型制备成功。饲养8周后,按随机数字表法将其与同龄非糖尿病大鼠分别在授时因子（zeitgeber,ZT）0、6、12和18四个时间点分为4组:非糖尿病假手术组（NS组,n=6）,非糖尿病缺血/再灌注组（NI/R组,n=12）,糖尿病假手术组（DS组,n=6）,糖尿病缺血/再灌注组（DI/R组,n=12）。通过结扎冠状动脉左前降支（left anterior descending coronary artery,LDA）进行缺血30min,松开结扎线进行再灌注120min构建心肌I/RI模型。TTC检测大鼠心肌梗死面积;ELISA法检测血清肌钙蛋白I（cardiac troponin I,c Tn-I）、肌酸肌酶同工酶（creatine kinase-MB,CK-MB）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）水平;透射电子显微镜检测心肌超微结构损伤;实时定量PCR检测心肌组织Rev-erbα、BMAL1、CEBP/β的m RNA水平;Western blotting检测心肌组织HDAC3、Rev-erbα、BMAL1以及自噬蛋白CEBP/β、BNIP3、Atg4b、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平。结果1.非糖尿病大鼠时钟基因Rev-erbα、BMAL1和CEBP/β的m RNA表达具有显著的昼夜节律性,而糖尿病大鼠心肌组织中Rev-erbα、BMAL1和CEBP/β的m RNA表达无显著昼夜节律。2.非糖尿病大鼠在ZT0、ZT6、ZT12、ZT18时间点行心肌I/R后,心肌损伤程度具有时钟基因节律相关性,且在ZT12的损伤程度达峰值,自噬水平最低;而糖尿病大鼠心肌损伤更加严重,且不同时间点心肌损伤和自噬水平无明显节律。3.糖尿病状态下心肌组织中的HDAC3和Rev-erbα水平升高,同时BMAL1表达降低,自噬水平下降;相比于假手术组,非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠心肌I/R后自噬水平均升高;但相比于非糖尿病大鼠,糖尿病大鼠心肌I/RI后自噬蛋白C/EBPβ和BNIP3表达升高,Atg4b和LC3Ⅱ/Ⅰ表达下降,自噬水平显著下调。结论糖尿病状态下时钟基因节律振荡失调,线粒体自噬水平下调,且心肌I/RI加重,可能与HDAC3水平升高和时钟基因振荡紊乱有关。第二部分心脏特异性敲除HDAC3在糖尿病心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用目的通过腺相关病毒特异性敲低SD大鼠心肌组织HDAC3表达,探究HDAC3在糖尿病心肌I/RI中的作用及对时钟基因介导的线粒体自噬的影响。方法采用健康成年雄性SD大鼠,腹腔注射STZ 60mg/kg制备1型糖尿病模型,血糖≥16.7mmol/L为模型制备成功。心肌I/R前3周通过尾静脉注射HBAAV9-r-HDAC3 sh RNA1-GFP和HBAAV9-GFP NC。继续饲养8周后,按随机数字表原则分为3组:糖尿病假手术组（DS组,n=6）,糖尿病缺血/再灌注组（DI/R组,n=12）,糖尿病缺血/再灌注+HBAAV9-r-HDAC3 sh RNA1-GFP组（DI/R+AAV9-HDAC3组,n=12）。采用结扎LDA缺血30min再灌注120min建立心肌缺血/再灌注损伤模型。冰冻切片检测腺相关病毒转染效率;TTC检测大鼠心肌梗死面积;ELISA法检测血清c Tn-I、CK-MB和LDH水平;实时定量PCR检测心肌组织Rev-erbα、BMAL1和CEBP/β的m RNA水平;Western blotting检测心肌组织HDAC3、Rev-erbα、BMAL1和CEBP/β以及自噬相关蛋白的表达水平。结果1.冰冻切片显示,尾静脉注射HBAAV9-r-HDAC3 shRNA1-GFP和HBAAV9-GFP NC后GFP信号表达明显,表明AAV-GFP-HDAC3和AAV-GFP-NC成功转染并表达于心肌组织;且与对照组相比,AAV-HDAC3转染组HDAC3蛋白水平显著减少。这表明尾静脉注射HBAAV9-r-HDAC3成功敲低心肌组织HDAC3表达水平。2.与DI/R组相比,DI/R+AAV9-HDAC3组心肌梗死面积,心肌细胞损伤和血清c Tn-I、CK-MB和LDH水平都显著减少。同时HDAC3和Rev-erbα表达降低、BMAL1水平显著上调,线粒体自噬水平明显增加。结论本实验结果证实,腺相关病毒AAV9-HDAC3通过下调HDAC3水平介导糖尿病心肌I/RI的保护作用,AAV9-HDAC3处理可显著上调线粒体自噬水平从而有效降低心肌细胞损伤,而这一作用可能与HDAC3调控的Rev-erbα/BMAL1信号通路介导线粒体自噬激活有关。第三部分HDAC3调控时钟基因介导线粒体自噬在原代心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用机制目的探讨HDAC3调控时钟基因介导线粒体自噬在原代心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤的作用机制。方法选择1-3天左右的新生SD乳鼠,提取原代心肌细胞,铺板。按随机数字表原则分为4组:（1）低糖组（LG,糖浓度5.5m M）;（2）低糖+缺氧/复氧组（LG+H/R）;（3）高糖组（HG,糖尿病30m M）;（4）高糖+缺氧/复氧组（HG+H/R）。进一步实验中,为了验证沉默HDAC3和Rev-erbα对原代心肌细胞高糖H/R损伤的影响以及调控BMAL1介导的线粒体自噬在此过程中发挥的作用,分为以下4组:（1）高糖+缺氧/复氧（HG+H/R）;（2）高糖+缺氧/复氧+si RNA对照组（HG+H/R+si NC）;（3）高糖+缺氧/复氧+si HDAC3沉默组（HG+H/R+si HDAC3）;（4）高糖+缺氧/复氧+si Rev-erbα沉默组（HG+H/R+si Rev）。对照组细胞置于37℃常氧（5%CO2,95%空气）环境下培养;H/R组细胞置于低氧环境（5%CO2+0.9%O2+94.1%N2）中培养6h,再置于常氧环境中复氧2h以建立H/R模型。CCK-8检测细胞活性;ELISA试剂盒检测细胞上清LDH水平;Mito Tracker Red CMXRos试剂盒检测细胞线粒体ROS水平;JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位;自噬双标腺病毒（m RFP-GFP-LC3）转染下共聚焦显微镜检测细胞自噬流水平;荧光定量PCR检测HDAC3、Rev-erbα、BMAL1和CEBP/β的m RNA水平;Western blotting检测心肌组织HDAC3、Rev-erbα、BMAL1以及自噬蛋白CEBP/β、BNIP3、p62和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平。结果1.与低糖组相比,高糖组原代心肌细胞HDAC3和Rev-erbα表达增高,BMAL1表达下调且自噬水平降低;H/R处理后,无论是低糖组还是高糖组,细胞存活率均显著降低,LDH活性增加,线粒体损伤明显,细胞自噬水平升高,且HDAC3和Rev-erbα表达增高,BMAL1表达下降。但与LG+H/R组比较,HG+H/R组细胞存活率显著降低,LDH活性增加,线粒体损伤加重,细胞自噬水平显著降低;且HDAC3和Rev-erbα表达增高,BMAL1表达下降。2.沉默HDAC3和Rev-erbα基因的si RNA转染原代心肌细胞后,能显著降低高糖H/R损伤,增加细胞活性和线粒体膜电位,减少LDH水平,同时上调BMAL1表达水平和线粒体自噬水平。结论本实验结果证实,HDAC3在高糖H/R诱导的原代心肌细胞损伤中具有重要作用;使用si RNA沉默HDAC3或Rev-erbα可显著上调线粒体自噬水平从而有效减轻心肌细胞损伤,其机制可能与激活Rev-erbα/BMAL1介导的自噬信号通路有关。