论文部分内容阅读
成纤维细胞生长因子（FGF）属于肝素结合生长因子家族（Heparin binding growth factor,HBGM）,其家族的成员在细胞和代谢稳态中具备很多作用。在进化过程中,FGF通过需要实现功能的差异和结构所形成的的不同可衍生出多个成员。在硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans,HSPGs）的作用下,FGF与成纤维细胞生长因子受体FGFR的胞外区IgⅡ和IgⅢ结合,在胚胎发育、成体组织重塑和维持体内平衡等方面起关键作用,用自分泌或者旁分泌的方式来促进细胞增殖和群体生长[1]。而除此之外,还有3种FGF具有内分泌作用,分别是FGF15/19、FGF21、FGF23,其中FGF23,主要来源于骨组织,由成骨细胞和骨细胞分泌,主要起调节机体磷的代谢的作用。内分泌型的FGF与HSPGs结合力下降,但是FGF23通过Klotho等的参与,Klotho-FGFRs复合物与单独的FGFRs相比,FGF23对其反倒具有更高的亲和力,可以更好的激活下游信号通路,介导其生物学活性。在慢性肾脏病骨与矿物质代谢异常（Chronic kidney disease,CKD-MBD,Mineral and bone disease）的病理过程中扮演了重要的角色,FGF23与Klotho形成Klotho/FGF23轴[2],共同维持机体的矿物质代谢内稳态。磷,作为体内的主要物质之一,在体内多以磷酸盐的形式存在,和钙一起共同参与骨形成、酸碱平衡、物质能量代谢等各种活动。作为体内调节磷的重要因素,如FGF23-KLOTHO系统受到抑制,可增加磷重吸收,导致高磷血症。相反,血磷水平升高后,FGF23可由骨组织分泌入血,增加尿磷排泄,抑制维生素D的合成,负向调控血磷[2]。现在的研究早就揭示了FGF23在调节骨形成、维持骨稳态方面有重要作用[3]。但FGF23对出生后骨发育和重建的影响和分子机制还不完全清楚,同时FGF23对如何影响成骨分化还未见报道。我们知道FGFR1和FGFR3都可能是FGF23的受体,但FGF23如何结合FGFRs发挥成骨的作用成为我们研究的重点。本课题包括以下两部分:1、FGFR1-3在成骨分化中的表达及作用研究;2、成骨分化中成纤维细胞生长因子FGF23在糖酵解调控中的作用。主要实验内容和方法如下:第一部分FGFRs信号通路在小鼠骨骼发育和重建中的表达及其作用机研究实验方法1、原代成骨细胞的分离培养和成骨诱导取3天内出生的新生小鼠分离颅骨成骨细胞,成骨诱导5、10、15天用碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase protein,ALP）染色/茜素红染色检测成骨分化情况、qRT-PCR检测成骨分化相关基因COL 1α、RUNX2、OPN的表达。2、成骨细胞分化过程中FGFR1-3的表达情况;提取成骨细胞的总RNA,然后利用qRT-PCR检测FGFR1-3的表达情况,并同时检测成骨细胞系在成骨诱导过程中FGFR1-3的表达情况。3、阻断FGFRs信号后检测成骨分化情况;在成骨细胞诱导成骨的过程中,加入FGFR信号阻断剂BGJ398后,利用ALP/茜素红染色的方法检测原代成骨细胞和成骨细胞系MC3T3-E1的成骨分化能力,利用qRT-PCR检测成骨分化相关基因COL 1α、RUNX2、OPN的表达,利用Western blot检测成骨分化相关蛋白COL 1α、RUNX2的表达情况。第二部分FGF23对成骨细胞糖酵解的调控作用。实验方法:1、FGF23对成骨分化能力的影响;用FGF23处理第一部分成功分离的原代成骨细胞,以及成骨细胞系MC3T3-E1,成骨诱导5天/15天后,ALP/茜素红染色检测成骨分化情况,以未加FGF23成骨诱导组作为CONTROL组。2、成骨细胞检测FGF23存在条件下糖酵解相关指标;用FGF23处理第一部分成功分离的原代成骨细胞,以及成骨细胞系MC3T3-E1,在处理后24/48小时提取上清检测葡萄糖消耗情况、乳酸产生情况、糖酵解水平,48小时后提取细胞总RNA,利用qRT-PCR检测糖酵解相关基因的表达情况,以未处理组作为CONTROL组。主要实验结果:1、在分离的原代成骨细胞中成骨分化检测;在原代成骨细胞中,形态观察发现成骨细胞状态良好,ALP染色发现蓝紫色颜色加深,茜素红染色发现红色钙结节增多,用qRT-PCR检测成骨分化过程中COL 1α、RUNX2、OPN等成骨分化相关基因,说明原代成骨分离成功,并用平行培养的成骨细胞系MC3T3-E1用以上方法重复步骤,发现一致的趋势。2、检测成骨分化过程中FGFRs的表达情况;FGFs/FGFRs信号是调节机体发育和稳态的重要信号通路,用qRT-PCR检测FGFR1-3的表达情况,发现随着时间延长,FGFR1-3增多。3、阻断FGFR信号发挥作用后成骨相关基因表达情况在成骨细胞成骨诱导过程中,加入FGFR信号阻断剂BGJ398后,ALP染色发现蓝紫色变浅,茜素红染色发现红色钙结节增多,qRT-PCR发现成骨分化过程中COL 1α、RUNX2、OPN等成骨分化相关基因的表达减少,用Western blot检测成骨分化过程中COL 1α、RUNX2的蛋白表达减少。4、用FGF23处理后发现成骨分化增强在成骨细胞成骨诱导过程中,加入FGF23后,ALP染色发现蓝紫色颜色变深,红色钙结节增多。5、用FGF23处理后,用试剂盒检测糖酵解相关指标加入FGF23处理后,相比于未处理组,葡萄糖消耗增多、乳酸产生增多、糖酵解水平升高,处理48小时后qRT-PCR检测发现糖酵解相关基因PFKFB2、PFKFB3、PFKFB4、ENO2、ENO3、LDHA的表达不同程度升高。主要结论:1、成功分离原代成骨细胞;2、FGFR1-3在成骨细胞分化过程中表达逐渐增加,抑制FGFR信号后成骨细胞成骨分化减弱,提示FGFR信号促进成骨分化;3、FGF23促进成骨细胞成骨分化,这与FGF23促进成骨细胞糖酵解有关。