研究背景和目的：近年来,由于钛和钛合金材料拥有优异的机械力学性能和良好的生物相容性,其骨内种植体被广泛用于口腔种植义齿修复、骨科关节置换术、骨折固位、骨缺损的修复等领域,并取得了较好的临床效果。但是由于钛金属表面为生物学惰性,使其在感染、肿瘤、或者患者伴有某些系统性疾病(如糖尿病、骨质疏松)等的情况下,种植体的成功率大为下降,甚至无法适用。特别是在种植体周围出现细菌感染的情况下,需要通过复杂的临床治疗手段控制感染,同时还有着种植体脱落、种植失败、长时间住院治疗、甚至死亡的风险。因此,为了克服这种由于材料惰性表面带来的问题和挑战,越来越多的研究致力于通过钛种植体表面改性的方法获得功能化种植体。在本课题组的前期研究当中,我们成功地通过电沉积(Electrophoretic deposition, EPD)技术在纯钛种植体表面制备了壳聚糖／明胶(Chitosan/gelatin,CSG)涂层,这种涂层具有良好的生物相容性,并且能够有效促进种植体周围骨结合,为种植体表面功能化提供了良好的载体。因此,在本研究当中,我们将四环素(Tetracycline, Tc)作为一种模型药物,载入到CSG涂层中,以制备具有抗菌性能的功能化种植体,并对其表面形貌、理化性质、机械力学性能、溶胀、降解、缓释性能、制备机理、体外和体内生物学表现进行系统性研究,为今后基于CSG涂层的种植体表面功能化提供理论与实验基础。研究方法：首先分别配制含不同浓度四环素(0、1mg/mL和10mg/mL)的壳聚糖／明胶电沉积液,分别标记为CSG、Tcl和Tc10。并对钛片进行喷砂酸蚀处理(Sand-blasting and acid etching, SLA),然后采用一步法电沉积技术在SLA钛片表面制备四环素／壳聚糖／明胶纳米涂层,并通过荧光显微镜和扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope, SEM)观察涂层表面形貌。之后通过对电沉积液的zeta电位检测、不同pH值条件下电沉积液的透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope, TEM)检测以及涂层降解液的TEM检测探讨涂层的制备机理。然后使用衰减全反射傅里叶变换红外光谱(Attenuated Total ReflectanceFourier Transform Infrared Spectroscopy, ATR-FTIR)分析涂层的化学组成和化学键的变化,X射线衍射(X-ray diffractometer, XRD)和微区XRD分析涂层的结晶情况,机械力学测试表征涂层的剪切粘接强度和拉伸粘接强度,并对涂层在磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)中的溶胀和降解性能,以及四环素在涂层中的载入和缓释性能进行检测。最后,在各组涂层表面培养前成骨细胞(MC3T3-E1),通过罗丹明-鬼笔环肽免疫荧光染色显示细胞骨架,检测细胞在材料表面的黏附和伸展情况,DAPI染色细胞核并计数,检测细胞在材料表面的生长情况：并通过体外抑菌环实验,以及对黏附于涂层表面和悬浮于涂层周围菌液内的活菌进行计数,表征涂层对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能；在新西兰兔股骨远端制备金黄色葡萄球菌急性感染的骨缺损模型,并植入带有不同涂层的纯钛种植体,或者术前预防性全身应用抗生素,术后通过对外周血白细胞计数、种植体周围骨组织匀浆液的细菌计数、骨组织样本硬组织切片的荧光显微镜观察,以及Goldner染色结合革兰氏染色评价涂层在体内的抗菌性能和应用前景。研究结果：通过一步法电沉积技术,在SLA钛片表面成功地制备了CSG、Tcl和Tc10涂层,在对涂层表面形貌的观察中发现,涂层具有宏观的三维多孔薄膜样结构,和微观的纳米微球结构,Tcl涂层中可见四环素的黄绿色荧光,Tc1O涂层表面还出现了黄绿色晶体。对涂层的制备机理的探讨发现,在电沉积液中,四环素、壳聚糖和明胶均带正电,相互排斥；在电沉积过程中,当阴极周围pH值改变时,可形成纳米微球结构,并且四环素、壳聚糖和明胶之间可通过彼此间的静电作用结合；随着壳聚糖在阴极周围脱质子化而析出,四环素／壳聚糖／明胶纳米涂层夹杂着氢气气泡共沉积到钛片表面。对涂层的ATR-FTIR检测显示涂层由四环素、壳聚糖和明胶组成,并且明胶中的氨基和羧基可能与四环素苯环上的氨基发生交联反应而结合；XRD和微区XRD结果显示涂层中的明胶呈典型的结晶态,并且四环素与明胶的交联使得明胶的结晶峰变高变窄,涂层的结晶度升高；机械力学测试表明Tc10涂层的剪切粘接强度和拉伸粘接强度均显著性高于CSG和Tcl涂层,分析原因可能是Tcl0涂层中更高的结晶度和有序化分子排列造成的；对涂层的溶胀和降解性能检测显示四环素的载入会降低涂层的吸水溶胀率,升高涂层的质量损失率,并且涂层中的四环素和明胶优先于壳聚糖,首先被释放出来;而四环素的载入与电沉积液中四环素的浓度呈正比,涂层中大部分的四环素在3小时内被释放到PBS缓冲液中。涂层表面的MC3T3-E1细胞骨架染色结果显示SLA钛片、CSG和Tel涂层均可支持细胞的黏附和伸展,并且细胞间可见大量丝状伪足连通,而Tc10涂层表面的细胞明显皱缩并团聚；细胞核计数结果表明Tc1涂层可支持细胞的生长,而Tc10对MC3T3-E1细胞表现出细胞毒性。体外抑菌环实验表明,Tcl和Tc10涂层均具有对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能,对活菌的定量计数结果显示,Tcl和Tc10涂层对黏附于涂层表面和悬浮于涂层周围菌液内的细菌均有抑制作用,特别是Tc10涂层表现出优异的抗菌性能。动物体内实验表明,Tc10涂层可以成功的应用于动物体内,并且显著性降低外周血白细胞计数和种植体周围骨组织匀浆液的细菌计数,其抗菌效果优于术前预防性全身应用抗生素；并且组织学切片染色结果显示,预防性用药组和CSG涂层组骨组织内均有金黄色葡萄球菌阳性染色,CSG涂层组内还可见微脓肿形成,而Tc10涂层组内无细菌阳性染色,在骨小梁边缘还可见四环素沉积和类骨质形成。研究结论：1.本研究成功地通过一步法电沉积技术在SLA钛片表面制备了四环素／壳聚糖／明胶纳米涂层,所制备的涂层具有宏观的三维多孔,和微观的纳米微球结构；2.首次通过实验探讨了使用电沉积技术在钛片表面制备四环素／壳聚糖／明胶纳米涂层的机理,为今后使用该技术制备其他功能性涂层提供了理论支持；3.通过对四环素／壳聚糖／明胶纳米涂层进行理化性质分析,证明了四环素、壳聚糖和明胶已共沉积到钛片表面,并且四环素和明胶之间可发生化学结合；此外,四环素的载入会提升涂层的结晶度,进而提高涂层的剪切粘接强度和拉伸粘接强度；4.对涂层的溶胀、降解和缓释性能研究表明,四环素的载入降低了涂层的溶胀率,加速了涂层的降解,并且四环素以突释模式释放；5.通过观察MC3T3-E1细胞在涂层表面的生长情况,我们发现含低浓度四环素的涂层(Tc1)可以维持MC3T3-E1细胞的黏附、伸展和增殖,而含高浓度四环素的涂层(Tc10)表现出对MC3T3-E1细胞的细胞毒性；6.针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抗菌性能检测表明,四环素的抗菌性能在涂层中得以完整保留,所制备的涂层对黏附于涂层表面的细菌和悬浮于涂层周围的细菌均具备优良的抗菌能力；7. 动物体内抗菌性能研究表明,四环素／壳聚糖／明胶纳米涂层可以成功的应用于动物体内,并且表现出了良好的抗菌性能,其抗菌效果优于术前预防性全身应用抗生素。8.作为首个将功能性分子载入CSG涂层内的相关研究,为将来在涂层中载入例如抗癌药物、基因片段、蛋白质分子、金属离子等的其他功能性分子,提供了理论和实验依据。