论文部分内容阅读
本研究分为以下二部分:
第一部分:
目的:乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在病毒复制、肝炎以及肝癌的发生发展中具有重要的作用。已经有文献提示HBx可以改变宿主细胞的表观遗传学修饰,从而调节基因的表达,但是具体的机制目前尚不清楚。本研究主要探讨HBx引起肝癌细胞表观遗传学修饰异常的分子机制。
方法:肝癌细胞株转染HBx的表达载体,采用3H-甲基掺入法测定细胞基因组DNA总体甲基化水平和总的DNA甲基转移酶活性;HBx调节基因的表达通过基因芯片技术筛选并采用荧光定量PCR验证;通过免疫共沉淀、亚细胞共定位以及GSTpull-down分析HBx与其他蛋白的在体内和体外的相互作用;启动子甲基化水平通过DNA亚硫酸氢盐测序来进行检测;蛋白质与启动子区的结合采用染色质免疫沉淀进行分析;在肝癌细胞中所得的结果在临床样本中进行验证。
结果:HBx不仅可以提高肝癌细胞基因组DNA总体甲基化水平和DNA甲基转移酶活性,还可以和DNMT1、DNMT3A、HDAC1直接相互作用,并把DNMT3A富集到一些基因如MT1F、IL4R的启动子区,导致这些基因的启动子高甲基化,从而抑制这些基因的表达。另一方面,由于DNMT3A被募集到某些基因的启动子区,而且DNMT3A的表达量并没有明显的增加,导致其他基因如IGFBP3、CDH6的启动子区所结合的DNMT3A量下降,进而导致这些基因启动子的低甲基化以及基因的高表达。在临床样本中MT1F和IGFBP3的表达水平以及启动子区的甲基化状态与HBx的表达明显相关。
结论:HBx与DNMT3A的相互作用引起的DNMT3A的重新分布,调节不同基因启动子的甲基化状态以及表达水平,可以很好地解释HBx导致的细胞局部高甲基化和局部低甲基化并存的现象,为阐明HBx介导的转录激活和转录抑制提供了新的分子机制。HBx介导的表观遗传学修饰异常以及转录调控可能在HBV的免疫逃逸和肝癌的发生发展中具有重要的作用。
第二部分:
目的:本实验室前期通过大批量芯片筛选,发现SCARA5在肝癌中表达下调,本实验主要研究SCARA5基因的生物学功能以及与肝癌发生发展的关系。
方法:构建SCARA5的真核和原核表达载体,表达蛋白并制备抗体,采用组织芯片技术分析SCARA5蛋白在肝癌组织中的表达;分析SCARA5的过表达以及表达下调对肝癌细胞生长、克隆形成能力、体外成瘤能力、粘附能力、迁移能力以及重组基底膜侵袭能力的影响:采用明胶酶谱分析基质金属蛋白酶(MMP)的活性。
结果:获得了特异性较好的SCARA_5抗体,利用这个抗体进行免疫荧光定位发现内源性SCARA5可以定位在细胞膜上。组织芯片的结果显示SCARA5蛋白在78.2%的肝癌样本中表达明显下降。SCARA5的过表达可以抑制Huh7、PLC等肝癌细胞的生长、克隆形成并抑制Huh7细胞的体外成瘤能力,还可以抑制LM3细胞的体外侵袭能力和MMP-9的分泌;另一方面,SCARA5的表达下调可以促进YY-8103、PLC等细胞的生长和软琼脂克隆形成,可以促进YY-8103细胞的体外成瘤能力和体外侵袭能力,并促进MMP-9的分泌。在组织芯片中有脉管癌栓形成的肝癌组织中SCARA5的表达明显降低。
结论:SCARA5的表达下调在肝癌发生发展过程中具有重要作用,另外本实验的研究还发现SCARA5在肝癌组织中表达的下调与染色体的缺失、杂合性丢失以及启动子的高甲基化有关。多种实验证据表明SCARA5具有抑癌基因的特点和功能,是一个候选的抑癌基因。