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1．系统探讨了放线菌酮（CHX）和细胞松弛素B（CB）对水牛卵母细胞孤雌激活的影响。IVM27～28h的水牛卵母细胞经7％酒精（EH）激活处理5min后，经7％酒精（EH）激活处理5min后，置入不同浓度的（0，0.625，1.25，2.5，5μg／ml）放线菌酮（CHX）培养10h，而后固定染色或在胚胎培养液（CM）中继续培养检查激活分裂率。结果培养在0.625和1.25μg／ml CHX的卵母细胞的激活分裂率和总原核形成率明显高于对照组（P＜0.05），而培养在5μg／mlCHX的卵母细胞的激活分裂率和原核形成率则极显著低于对照组（P＜0.01）。如果在含有0.625μg／ml CHX中添加3μg／ml CB，可明显提高双原核的形成率（38.9％vs15.1％，P＜0.05）和桑椹胚／囊胚发育率（40.7％vs26.8％，P＜0.05），但对其激活分裂率和总原核形成率无明显影响（P＞0.05）。结果表明，适当浓度的CHX能提高卵母细胞激活效果，适当浓度的CB可抑制卵母细胞第二极体的排出，提高孤雌激活后双原核的比例。 2．对水牛卵母细胞的激活方法进行了进一步的研究。IVM26h水牛卵母细胞经7％EH、钙离子载体（A23187）或离子霉素（Ion）激活处理5min后，在2mmol／L6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）中培养3～4h，然后再培养6～11d观察其胚胎发育情况。结果发现，5μmol／L Ion激活处理水牛卵母细胞分裂率（63.0％vs54.2％，P＜0.05）及原核形成率显著高于EH处理的卵母细胞。激活处理前，无Ca2+培养液孵育时间的长短，对水牛卵母细胞孤雌发育无明显影响（P＞0.05）。如用A23187激活处理水牛卵母细胞，其激活分裂率随着浓度的升高而提高。结果表明，Ion能非常有效地激活水牛卵母细胞。 3．探讨了受体卵母细胞的成熟和去核时间对水牛核移植效果的影响。卵母细胞IVM16～18h与IVM19～21h的成熟率之间有显著差别（43.0％vs 58.2％，P＜0.05），与22～24h组的成熟率之间有极显著差别（43.0％vs 68.8％，P＜0.01），而采用盲吸法去核的去核率则随着去核时间的延长而显著下降。在体外成熟16～24h期间，水牛卵母细胞去核时间的不同对核移植后的融合率，分裂率和囊胚发育率没有显著影响。结果表明，水牛卵母细胞的成熟率随着成熟时间的延长不断提高，而去核率呈下降趋势，但对其随后的核移植效果没有显著影响（在IVM16～24h期间）。 4．对采用6-DMAP调整去核操作时间的可行性进行了探讨。水牛卵母细胞先经 水牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植的研究 6－DMAP抑制成熟培养3～sh，再在正常成熟培养液中成熟培养16～18h。 结果发现，与直接在正常成熟培养液中成熟培养16～18h的卵母细胞相比， 其融合率，分裂率和囊胚发育率均无显著影响。山此表明，6oMAP可用于 调整水牛卵母细胞的去核操作时间。5．利用Spindle－View系统对水牛卵母细胞成熟培养时间与细胞核和PBl的位置 关系，以及利用该系统提高去核率的可行性进行了探讨。结果发现，随着卵 母细胞成熟时间的延长，卵母细胞的核与PB；的相对距离增大。体外成熟18h， 20h和 22h的卵母细胞，其细胞核与 PB；位置较近的比例较大（分别为 72石％， 67．9％，64刀％），但当成熟时间增加到 24h时，这一比例下降到 57石％（726％ vs 57石％，P＜0刀5），如采用 Spindle－View系统去核贝可消除这种位置变化对去 核率的影响。由此表明，SPindle－View系统可用于提高卵母细胞的去核率。6．探讨了冷冻保存处理对水牛卵巢颗粒细胞核移植效果的影响。结果发现，颗 粒细胞冷冻保存后再进行核移植的融合率明显下降历7．4％VS 78．7％，P＜0．05人 但随后的分裂率，囊胚发育率无显著变化（P＞0刀5）。由此表明，冷冻保存处 理对细胞核的发育潜能无显著影响，但可能损伤细胞表面的微绒毛，进而影 响细胞间的融合。7．探讨了供体细胞培养处理方法对其核移植效果的影响。水牛颗粒细胞和成体 耳部成纤维细胞经正常培养（DMEM＋10％FCS）、血清饥饿培养 （DMEM＋0．5％FCS 5－10d）或 Aphidicolin（APD）结合血清饥饿培养（0．lqghl APD 24h，0．5％FCS 2叶8d）处理后，分别采用电融合法和直接注核法进行核 移植。结果发现，同一供核细胞各处理组间的核移植胚融合率（以颗粒细胞 作供核）和重组胚的囊胚发育率无显著差异T叩．05入 但经APD门4h)和 0．5％FCS乃～10d)培养处理的供体细胞，其重组胚的分裂率显著高于其它组 （P＜0．05），而其它各组间的分裂率无显著差异T＞队05)。结果表明，血清饥 饿处理水牛供体细胞对其核移植没有显著影响，但DNA合成抑制剂APD结 合血清饥饿培养处理供体细胞，可提高其核移植效果。8．对水牛核移植胚胎的体内发育潜能进行了评定。将来自颗粒细胞和成体成纤 维细胞的12枚核移植胚胎移植到6头受体水牛，其中有一头受孕，5头受体 水牛陆续出现返情。受孕母牛妊娠7个月时，发生流产，产下一s．s ig雄性 死胎(来自22岁的摩拉公牛耳部成纤维细胞人 山此表明，来自高龄公水牛 体细胞的核移植胚胎可以发育到妊娠后期。9．探讨了乙醇预激活水牛成体耳部成纤维细胞对其核移植效果的影