研究背景世界上女性患恶性肿瘤前7位中包括3种妇科癌症:宫颈癌、子宫内膜癌及卵巢癌。卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,在2012年宫颈癌、子宫癌和卵巢癌的比例为5.0%、5.9%和2.8%[1],发病率居第三位。卵巢癌发病率和死亡率呈上升趋势,每年的增长率分别为1.8%和0.6%[2]。卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤[3]。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖结构及内分泌功能较复杂,卵巢癌发病早期症状不典型,术前不易鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性。因卵巢癌无早期发现手段,确诊时约75%为晚期。卵巢癌治疗原则为手术及术后化疗相结合的综合治疗。尽管20%-25%早期卵巢癌患者经卵巢癌分期手术5年生存期达90%以上,仍然有25%-40%有高危因素患者需术后化疗,晚期卵巢癌经满意的肿瘤细胞减灭术,经以紫杉醇加卡铂标准方案化疗,完全缓解率达50%,但晚期卵巢癌中位无进展生存期仍未超过2年。卵巢癌治疗结果并不令人满意,因此不少学者致力于研究卵巢癌发病致病因素,提高一线化疗药物疗效及选择新型化疗药物等方面的研究。肿瘤的发生发展与肿瘤细胞、细胞间质、免疫炎症细胞和肿瘤血管的共同作用有关,肿瘤生长、发展、转移与侵袭不但与肿瘤细胞的遗传突变有关,而且与肿瘤间质微环境有关。炎症与肿瘤的关系主要研究一下两方面:炎症性细胞因子白介素-17的功能和信号转导机制;Nod样受体(病原和细胞应激识别受体)的功能及其信号转导激活机制[4]。IL-17为TH17细胞分泌的特征性细胞因子[5],大约有32KD,有六个IL-17 家族成员:IL-17A(IL-17)、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(亦命名为IL-25)和IL-17F。IL-17F与IL-17有最高的同源性(约50%),而且其编码基因定位于染色体的同一区段6p12[4]。CD4+IL-17+细胞产生的IL-17和IFN-γ还可以通过肿瘤细胞协同诱导Thl型CXC趋化因子配体(CXCchemokine ligand,CXCL)9和CXCL10的产生,后两者可以动员效应T细胞进入肿瘤微环境。在上皮性卵巢癌的研究中发现,肿瘤微环境中的Treg细胞(调节性T细胞:Regulatory cells)可以通过IL-2转化为CD4+IL-17+细胞,从而减轻Treg细胞介导的免疫抑制作用。近来研究表明,阻断PI3K通路能够上调IL-17RA可能增强IL-17信号[6]。IL-17可以介导磷酸化级联反应来失活C/EBPb[7]。IL-17通过IL-17RA的SEFIR-TILL结构域激活Erk,从而磷酸化C/EBPb的Thr188,而Thr188的磷酸化也是IL-17通过IL-17RA的末端结构域介导GSK3b磷酸化C/EBPb的Thr179所必需的。这两个依次的磷酸化事件导致了 C/EBPb的失活从而负向调节IL-17[4]。IL-17在不同类型的肿瘤组织中发挥作用。有学者分析了结肠癌肿瘤微环境中各种T细胞亚群的分布及其与患者预后的相关性,结果表明CD4+IL-17+细胞高表达的患者预后较差,而Th1细胞高表达患者的预后较好[8]。在肝癌模型的研究中发现,肿瘤组织中IL-17+细胞与肝癌患者的预后呈负相关[9]。有学者研究IL-17通过TGF-β1介导的Smad2/3 and ERK1/2信号途径促进EMT促进特发性肺纤维化[10],另有学者通过对胃癌细胞的研究发现,IL-17通过EMT促进疾病进展[11]。IL-17有上皮间质化作用,IL-17+细胞有望成为一个潜在的评估患者预后的指标。卵巢癌细胞具有转移侵袭性可导致卵巢癌复发转移,预后不良。卵巢癌可以通过腹腔种植、局部扩散、淋巴转移与血行转移等途径转移。其中腹膜转移是最常见的转移途径,Ⅲ期与32%-47%的5年生存率有关。学者研究卵巢癌转移复发机制并渴望寻找改善卵巢癌患者预后的治疗途径。研究表明,miRNA与卵巢癌发病机制、诊断、治疗及预后方面有密切关系。近年来研究miRNAs治疗成为癌症治疗的一种潜在途径。调控TH17分化的调节因子也先后被发现,包括STAT3、RORa、IRF4、BATF、AHR、NLRP3 和 micoRNA-326 等正调因子以及Ets-1、IBP、STAT5、Foxp3 等负调因子[4]。MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为18-25nt的非蛋白编码小RNA,它通过结合靶基因mRNA的3’UTR而抑制基因的表达,表现为一种转录后调控基因表达的全新机制,在细胞发育、免疫应答、炎症反应及肿瘤发生发展等生理与病理过程中均发挥重要调控作用。miRNA通过调控靶基因来发挥作用。miRNAs在肿瘤发生中可以起到癌基因或抑癌基因的作用,在卵巢癌中发挥抑癌基因作用的miRNA,如 let-7d、miR-127、miR-15a、miR-34a 和 miR-34b 等下调促进卵巢癌发生。研究者检测miRNAs在卵巢癌患者组织、血循环中表达情况来研究其致癌或抑癌作用,并可以根据不同组织的miRNA表达情况用来研究特定miRNA调节的基因,用以研究上调及下调miRNA后调控的基因功能缺失及获得表型,了解miRNA与疾病的关系。将来可能将miRNA作为疾病诊断的新型生物学标记,模拟分子使其成为靶向药物为恶性肿瘤治疗提供新的治疗手段。miRNA在多种生物过程中起调节作用,如调节细胞周期、分化、增值、凋亡及血管形成。同一 miRNA可以调节多个基因,同一个基因又可以受到多个不同miRNA的调节。多种miRNA影响卵巢癌的侵袭迁移能力。上皮间质化EMT为促进上皮细胞发生转移的重要途径[12-15],表现为上皮性标志物E-cadherin下调,间质化标志物 N-cadherin、ZEB1、ZEB2、Vimentin 上调。miR-200/ZEB1双向调控是EMT主要调节者之一[16],多项研究表明,卵巢癌中miRNA-200家族调控靶基因ZEB1和ZEB2。miR-506也是一种关键的EMT抑制基因,通过直接作用于靶基因SLUG(SNAI2)、vimentin和N-cadherin这些间质表型的关键分子发挥抑癌作用[17]。过表达miRNA-544a在胃癌中通过E-cadheri的减少,Vimentin上调促进EMT促进胃癌发展,作为WNT信号通路的主要成分的AXIN2和APC2为miR-544a的直接间接靶基因,miR-544a诱导EMT[18]。在另一项研究中,上皮性卵巢癌细胞转染EMT促进因子HMGA2降低了 miR-15a,miR-18a,miR-22和miR-29b的水平而Let-7家庭成员表达高升高。靶基因与miRNA之间可以互相调控,实现在上皮和间质之间转化。最近,microRNA被证明参与了正常的成纤维母细胞转变为癌症相关纤维细胞,通过对miRNA-31和miRNA-214和miR-155的下调,而趋化性因子CCL5被确定为miR-214的靶基因,这表明在肿瘤微环境的调控中起到重要作用。其他重要的细胞过程如:缺氧和血管生成在卵巢癌中受miRNAs调控。miRNA-199A的3-UTR端相关靶基因HIF-1α和HIF-2α,在缺氧环境下,miRNA-199a的表达降低,导致了 HIF的升高。miR-200的成员能够通过抑制靶基因CXCL1和IL-8来抑制血管生成,降低恶性肿瘤形成。这给予我们提示,卵巢癌致病因素及过程并不是单一途径,利用卵巢癌的致癌基因与miRNA之间关系及miRNA致癌基因与肿瘤微环境中细胞因子、炎症因子关系来调控降低卵巢癌发生转移。第一部分炎性细胞因子在上皮性卵巢癌的表达及其相关性实验目的:通过检测IL-17在上皮性卵巢肿瘤的表达,研究其与临床特点的相关性,研究其与EMT的关系,探索其与卵巢癌诊治及预后的关系。实验方法:收集山东大学齐鲁医院妇科自2013年1月至2015年12月收住院的卵巢恶性上皮性肿瘤术后组织标本50例。均经病理诊断证实为恶性上皮性肿瘤,10例良性卵巢上皮性肿瘤组织及10例正常卵巢上皮组织作为对照。免疫组化检测炎症细胞因子IL-17A、IL-17D、上皮性标志物E-cadherin及间质性标志物Vimentin在卵巢恶性上皮性肿瘤组织、卵巢良性上皮性肿瘤组织及正常卵巢上皮组织中的表达情况。分析细胞因子及上皮-间质标志物与临床特点的相关性。实验结果:1.IL-17A的表达从实验可见,切片染色后IL-17A呈棕黄色位于细胞浆IL-17D位于细胞膜及细胞浆,表现为浅黄色染色。IL-17A和IL-17D在卵巢恶性上皮性肿瘤组织中强阳性表达,而卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢上皮组织不表达。2.通过免疫组化结果发现,50例恶性卵巢上皮性肿瘤被分为IL-17A阳性组及IL-17D阳性组。IL-17A及IL-17D在临床分期晚期及肿瘤分化程度呈低分化组织中高表达,在病理类型上IL-17A及IL-17D表达统计学上没有明显差异。无腹水及腹水量少于500ml及腹水超过500ml,IL-17A和IL-17D在二者表达率统计学上无明显差异。IL-17A和IL-17D表达阳性率高组Vimentin表达阳性率也高,而E-cadherin表达阳性率低。实验结论:1.与正常卵巢组织及良性上皮性卵巢肿瘤组织相比较,上皮性卵巢癌组织中IL-17A、IL-17D及Vimentin阳性表达率高。而E-cadherin在上皮性卵巢癌中低表达,在卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中阳性表达率高。2.高临床期别、低分化上皮性卵巢癌IL-17A、IL-17D及Vimentin高表达。而E-cadherin表达阳性率低。腹水的量及上皮性卵巢癌组织类型的表达阳性率无明显差别。3.这一结果推测炎症细胞因子及间质化标志物共同促进卵巢癌侵袭性转移性。第二部分miRNA-544a在卵巢癌中的表达及对卵巢癌的生物学行为研究实验目的:通过RT-PCR检测miRNA-544a在正常卵巢上皮组织及上皮性卵巢癌组织中的mRNA表达,正常卵巢上皮细胞及卵巢癌细胞系A2780、HO8910、SKOV3中miRNA-544a的表达,研究其与临床特点的相关性,探索其与卵巢癌转移侵袭性的关系。通过在卵巢癌细胞株中分别过表达miRNA-544a mimics,检测miRNA-544a对卵巢上癌细胞的迁移侵袭性影响,并通过RT-PCR及Western blot检测过表达后细胞中的E-cadherin(CDH1)和Vimentin的mRNA及蛋白表达水平,以判断miRNA-544a促进卵巢癌发生发展的机制。实验方法:收集山东大学齐鲁医院妇科自2015年11月至2016年11月收住院的卵巢恶性上皮性肿瘤术后组织标本36例,均经病理检查诊断为恶性上皮性肿瘤。13例正常卵巢上皮组织。RT-PCR检测miRNA-544a在正常卵巢上皮组织及上皮性卵巢癌组织中的mRNA相对表达量,上皮性标志物E-cadherin及间质性标志物Vimentin的mRNA水平在卵巢恶性上皮性肿瘤、正常卵巢上皮组织中的表达情况。采用免疫印迹法,检测随机抽取3例卵巢癌组织及正常卵巢组织E-cadherin及Vimentin的蛋白表达情况。Transewell小室迁移侵袭实验检测过表达miRNA-544a对卵巢癌细胞迁移侵袭性的影响。RT-PCR检测在转染miRNA-544a mimics后上皮性卵巢癌细胞中的CDH1和Vimentin的mRNA水平相对表达量,免疫印迹检测转染后卵巢癌细胞中E-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平。实验结果:1.miRNA-544amRNA水平在卵巢恶性上皮性肿瘤组织中显著升高,而正常卵巢上皮组织中低表达。2.miRNA-544amRNA水平在正常人卵巢上皮细胞HOSepiC中低表达,上皮性卵巢癌细胞A2780、HO8910、SKOV3中高表达。3.在免疫印迹实验中:检测随机抽取3例卵巢癌组织及正常卵巢组织,检测癌组织中E-cadherin的蛋白水平表达低于正常卵巢组织中的蛋白水平,而Vimentin在癌组织中蛋白水平高于正常卵巢组织的蛋白水平。4.Transwell小室实验发现miRNA-544a过表达有促进卵巢癌细胞迁移侵袭性的能力。5.RT-PCR检测在转染miRNA-544amimics后上皮性卵巢癌细胞中的CDH1 mRNA水平下调而Vimentin的mRN水平上调。6.在免疫印迹实验中,上调miRNA-544a后检测癌细胞中E-cadherin的蛋白水平表达降低,而Vimentin蛋白表达水平升高。实验结论:1.与正常卵巢组织相比较,上皮性卵巢癌中miRNA-544amRNA及Vimentin mRNA水平高表达。而E-cadherin的mRNA及蛋白水平在上皮性卵巢癌中低表达。正常卵巢上皮细胞及正常卵巢组织中miRNA-544a低表达,E-cadherin的mRNA水平及蛋白水平高表达,Vimentin的mRNA及蛋白水平低表达。2.在卵巢癌细胞中过表达miRNA-544a后CDH1 mRNA水平及蛋白水平下调,而Vimentin的mRNA及蛋白水平表达水平升高。3.迁移侵袭实验验证miRNA-544a过表达促进卵巢癌细胞迁移侵袭性的能力。4.研究结果提示miRNA-544a可能通过降低上皮性标志物E-cadherin,升高间质标志物Vimenrin促进EMT促进卵巢癌的发生发展。