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目的:目前的研究表明CML的主要发病机制是细胞凋亡受阻,如何诱导细胞凋亡是人们探讨药物治疗CML的主要目标。本研究通过利用三尖杉酯碱(harringtonine,HT)诱导慢性髓系白血病K562细胞凋亡的实验模型,明确K562细胞凋亡的早期阶段和晚期阶段。应用比较蛋白质组技术,寻找并鉴定与细胞凋亡相关的蛋白质,探讨药物促进白血病细胞凋亡的分子机制。 方法:应用Annexin V和PI双染法,通过流式细胞术区分HT诱导K562细胞凋亡早期和凋亡晚期阶段。应用荧光染色、DNA电泳、流式细胞术明确了HT诱导K562细胞凋亡过程的阶段性及周期阻滞特性。并进一步运用比较蛋白质组的研究方法,对HT诱导K562细胞凋亡的相关蛋白进行“蛋白差异显示”、质谱鉴定和数据库查询。 结果: 1、HT(10μg/ml)作用K562细胞5小时、12小时和24小时,AnnexinV+/PI-的凋亡早期细胞分别为28.3%、20.1%、18.1%;Annexin V+/PI+的凋亡晚期细胞分别为9.1%、15.3%、20.2%。PI单染的FACS结果显示凋亡率分别为8.9%、21.4%和37.4%。荧光染色显示的形态学变化和DNA电泳,表现出了同样的趋势。FACS显示随着HT作用时间的延长细胞阻滞于G0/G1期。通过上述的定性和定量检测,结果表明在HT诱导K562细胞5小时和24小时时,凋亡细胞主群处于凋亡早期和凋亡晚期阶段。 2、利用制备型双向电泳,分离正常细胞和HT诱导5小时及24小时凋亡细胞蛋白。经Imagemaster 2D Elite v3.01图象分析软件进行初步分析,结果表明:三组细胞的蛋白图谱具有较好的相关性和可比性。进一步,选择3块凝胶进行配比(match),统计分析表明:在凋亡组中3个斑点消失,7个斑点表达量显著降低,10个斑点表达量显著升高。3、选择10个出现量变并且蛋白表达量较大的斑点进行质谱鉴定。鉴定出8个蛋白,其它2个蛋白斑点未出现明确的数据库查询结果。在已鉴定的蛋白中,5个蛋白斑点比较明确,分别为keratin9、BTF3、聊tophapltRNAsgnthetase、DJ-l和prohibiun。 结论:在凋亡细胞中 tryptophanyltRNA spothetase、DJ刁和 pombitin表达上调以及BTF3表达下调,主要影响核酸转录和蛋白合成。kerang表达增加是一种凋亡抵抗反应。对这些蛋白的深入研究,必将有助于加深对HT诱导K562细胞凋亡的认识。