前言先天性肛门直肠畸形(anorectal malformation,ARMs)是小儿常见的消化道畸形,是世界卫生组织常规监测的先天畸形之一,占消化道畸形的1/4,发病率为1/5000～1/1500。术后有近1/3患儿合并不同程度的排便排尿功能障碍,严重影响患儿的生活质量,该病是主要危害我国儿童健康的先天畸形之一。先天性肛门直肠畸形的病因仍不清楚。目前认为,肛门直肠畸形的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。流行病学和动物实验表明遗传因素在其发病过程中发挥重要作用。最近国外学者利用肛门直肠畸形动物实验研究发现,Shh基因、Gli2基因、Gli3基因、Hox基因、Fgf10基因、Bmp4基因、Wnt5a基因、Eph和ephrin基因的B亚类、Sall基因在消化道末端发育中发挥重要作用。当上述基因异常均可导致动物出现肛门闭锁、肛门开口异位等畸形。由于肛门直肠畸形发病机制和病理改变十分复杂,多伴发其他畸形,遗传方式和外显率尚不清楚,涉及的相关基因较多,且可供研究的家系和标本严重匮乏,因而对其致病基因的研究进展缓慢,短时间内难以有所突破。人类先天性肛门直肠畸形基因水平的研究国内外报道较少,至今尚无先天性肛门直肠畸形相关基因得到定位。因此从分子水平探索人类先天性肛门直肠畸形的发病机制具有十分重要的意义。基因芯片也称为基因微阵列,是指在有限的载体上加载大量基因信号,可以用有限的标本,在短时间内、条件几乎一致的情况下,检测大量基因的表达情况,从而提供全面可靠的基因表达谱。应用基因表达谱芯片对正常儿及肛门直肠畸形患儿消化道末端进行基因表达分析,筛选出差异表达基因。对差异表达较显著的基因,扩大样本量,经过RT-PCR验证可靠,并且利用医学生物信息学分析。实验观察所筛选的基因在大鼠胚胎中晚期消化道末端表达的时空性;并且应用免疫组织化学、RT-PCR和蛋白印记研究筛选基因在人类肛门直肠畸形的直肠末端的表达;在此基础上应用限制性片段多态性(RFLP)选择筛选基因的单核苷酸多态性标记(SNP),从遗传学探讨筛选基因多态与肛门直肠畸形的关系,寻找肛门直肠畸形致病基因。这将为解决人类先天性肛门直肠畸形的产前诊断、畸形预防和发现新的治疗手段提供可靠线索。材料和方法一、实验材料1、临床组织标本收集近一年来在我院治疗的各类无肛畸形病例36例,作为病例组。收集直肠外伤、死于非胃肠道畸形患儿等无畸形患儿病例17例,做为对照组。术中无菌取直肠末端全层肠壁,放入无RNA酶的锡纸中,立即至于液氮中保存。2、实验动物体重230-250克的Wistar大白鼠由中国医科大学动物部提供。3、血样标本65例ARMs患者,115名无血缘关系的辽宁汉族健康个体,采用EDTA抗凝外周静脉全血0.2ml。二、实验方法1、基因表达谱芯片对肛门直肠畸形患儿和正常儿直肠末端组织进行表达谱研究2例先天性高位肛门闭锁患儿和1例死于非胃肠道疾病患儿,取直肠末端组织。采用Trizol一步法提取组织的总RNA,反转录成cDNA,转录合成cRNA,合成的同时进行生物素标记。生物素标记的cRNA探针经片段化处理后与芯片杂交,扫描仪上扫描芯片。应用GCOS软件进行数据分析。将所获探针号于NetAffy网站(www.afrymetrix.com)中查询出对应的基因和生物学信息。2、部分差异表达基因表达水平的实验验证中高位ARMS患儿直肠后壁末端标本36例;对照组由8例死于非胃肠道疾病患儿的直肠末端标本,术中无菌留取直肠末端全层标本。应用RT-PCR的方法对筛选出的7个表达差异基因进行了研究,以验证基因芯片的可靠性和可信度。表达上调的基因:RHOB、HOXA5;表达下调的基因:NKX3-1、SALL1、MMP7、SOX11、EPHB2。3、EphB2与先天性肛门直肠畸形关系的研究①用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸Wistar孕鼠24只肛门直肠畸形动物模型,根据切片观察后分为给药无畸形组(n=90)和畸形组(n=108),胎龄13d-16d、18d和20d的正常胎鼠(n=111)作为正常对照组。正中矢状面、水平面连续切片,EphB2免疫组化染色。连续动态对比观察EphB2在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠发育过程中的表达。常规制备胎鼠冰冻切片,解剖显微镜下手工显微切割方法准确切取泄殖腔标本,从中提取总RNA,通过RT—PCR方法研究EphB2 mRNA在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠的表达。②采用免疫组织化学法、免疫荧光分析方法、RT-PCR方法和Western蛋白印迹方法,检测31例不同类型先天性肛门直肠畸形直肠后壁末端、5例后天瘘及8例正常直肠后壁末端EphB2在蛋白水平和mRNA水平的表达情况,应用单因素方差分析比较正常组和畸形组、不同类型的畸形组之间EphB2表达水平的差异。4、EphB2基因多态性与先天性肛门直肠畸形相关性研究采用PCR—RFLP方法,对65例ARMS患者和115名正常人EphB2基因-1395A/G多态位点进行基因型检测,用SHEsis在线统计软件分析等位基因频率、基因型频率及其组间差异。结果1、基因表达谱芯片对肛门直肠畸形患儿和正常儿直肠末端组织进行表达谱研究肛门直肠畸形直肠末端与正常直肠末端组织中表达差异在2倍以上的基因有776条,其中ARMs下调的基因有399条,上调基因377条。差异表达的基因4倍以上的基因259条,其中ARMs下调的基因有150条,上调的基因109条。差异表达基因以发育分化、信号转导传递、细胞生理过程及调节基因为主,同时还涉及核酸转录翻译、凋亡调节、细胞骨架、免疫应激、物质合成代谢及运输等不同层次、不同功能的基因。2、部分差异表达基因表达水平的实验验证RT-PCR技术验证的7个差异表达基因中,RHOB、HOXA5基因在高位肛门闭锁患者直肠末端组织中的表达水平高于正常对照,而SOX11、MMP7、SALL1、NKX3-1和EPHB2基因在高位肛门闭锁患者直肠末端组织中的表达水平明显低于正常对照。3、EphB2与先天性肛门直肠畸形关系的研究(1)在大鼠中晚期胚胎研究中免疫组化实验中,EphB2在大鼠发育过程中正常及给药无畸形组胚胎泄殖腔中表达,在13d和14d主要表达于尿直肠隔和泄殖腔膜,胚胎15d时在尿直肠隔与泄殖腔膜融合处EphB2表达较强,16d时肛膜破裂,肛门直肠形成,EphB2在直肠粘膜层表达。EphB2在肛门直肠畸形胎鼠泄殖腔和直肠粘膜层亦有表达,测量单位面积内累积光密度值,胎龄13-16d时与正常对照组和给药无畸形组比较值明显减小,有统计学意义(P＜0.05)。应用RT-PCR实验发现在正常和畸形组大鼠胚胎中均能检测出EphB2表达,在胎龄13-16d为表达高峰期,胎龄16d后逐渐降低。畸形组与正常对照组和给药无畸形组相比较,EphB2 mRNA的表达在13-16d明显降低,有统计学意义(P＜0.05)。(2)在人类先天性肛门直肠畸形直肠末端组织中,免疫组织化学检测到EphB2蛋白在畸形组和对照组均有表达,定位在直肠肠壁粘膜层细胞的胞浆和胞膜中,先天性肛门直肠畸形末端肠壁EphB2基因mRNA相对表达量明显低于正常对照组(P＜0.001)。不同类型的畸形组之间,高位组和中位组之间差异无统计学意义(P=0.33),但二者明显低于低位组(P＜0.001)。后天瘘组与正常对照组比较没有明显差异(P=0.63)。Western蛋白印迹结果显示,先天性肛门直肠畸形高位组、中位组和低位组蛋白表达水平均明显低于后天瘘组和正常对照组(P＜0.001)。不同类型的畸形之间,高位组和中位组之间无明显差异(P=0.11),但二者明显低于低位组(P＜0.01)。后天瘘组与正常对照组比较没有明显差异(P=0.67)。4、EphB2基因多态性与先天性肛门直肠畸形相关性研究EphB2受体基因第6外显子的-1395A/G多态A等位基因频率及AA基因型频率在ARMs组(0.854、0.754)与正常对照组(0.170、0.043)差异显著(P＜0.01)。结论(1)基因芯片可有效筛查出肛门直肠畸形发生的相关基因,包括发育分化、信号转导传递、细胞生理过程及调节、核酸转录翻译、凋亡调节、物质合成代谢及运输等多种基因,这表明在ARMs的发生发展中有多种类型的基因参与。(2)初步筛查出差异表达基因2倍以上776条,4倍以上259条。其中与发育相关基因,上调基因RHOB和HOXA5;下调基因SOX11、MMP7、SALL1、NKX3-1和EPHB2,验证的表达趋势与在基因表达谱中的变化一致,提示本研究中基因表达谱的实验结果具有较好的可信度和可靠性,深入分析差异表达基因与先天性肛门直肠畸形之间的关系将可能为阐明先天性肛门直肠畸形的病因及病理生理学提供新的理论依据。(3) EphB2可能在大鼠胚胎期泄殖腔和直肠的正常发育和畸形发生过程中起重要作用。(4) EphB2在人类先天性肛门直肠畸形直肠末端低表达,EphB2在人类先天性肛门直肠畸形的发生中可能具有重要作用。(5) EphB2受体基因第6外显子的-1395A/G多态与先天性肛门直肠畸形存在相关性。(6) EphB2可能在泄殖腔和直肠的发育中起重要作用,与肛门直肠畸形的发生相关。