研究目的急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection,ARTI)是人类致病和致死的最主要原因之一,病原学复杂[1]。呼吸道病毒作为重要的病原体,感染力强、传播快、潜伏期短、发病急[2],如果未能及时明确病原体,容易造成病情迅速进展及抗生素滥用。快速准确的病原学分析不仅是确定临床诊断的重要依据,也是合理选择治疗方案的基础。加强呼吸道疾病病原学诊断意识,对于呼吸道感染性疾病的正确诊治及有效防止交叉感染和抗生素滥用至关重要。本研究收集解放军三〇七医院住院和门诊呼吸道感染患者的咽拭子标本,对流感病毒(influenza virus,IFV)及其亚型、副流感病毒(parainfluenza virus,PIV)及其亚型、人偏肺病毒(human metapneumovirus,HMPV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)及其亚型、人博卡病毒(human bocavirus,HBOV)、鼻病毒(human rhinovirus,RHV)、腺病毒(adenovirus,ADV)和人冠状病毒(human coronavirus,h Co V)进行检测,研究本院呼吸道病毒在感染性疾病中的分布及变异规律,探讨呼吸道病毒感染及流行特点变化,快速准确地鉴别病原微生物,动态掌握呼吸道病毒的分布特征、变异趋势,旨为本地区呼吸道感染性疾病流行病学及预防性干预措施的制定,应对新发、突发呼吸道感染性疾病及呼吸道传染性疾病传播,制定正确的控制方案提供有力的科学根据。为呼吸道感染患者早期明确病原诊断及个体化针对性治疗提供实验室依据。以有效避免抗生素滥用导致的二重感染和交叉感染,进一步提高呼吸道感染性疾病的诊疗水平。研究对象收集2015年9月至2016年12月解放军三〇七医院发热呼吸道症候群患者咽试子1080份,检测8种呼吸道病毒及亚型。其中男性584份,女性496份,患者年龄在12~83岁之间,中位年龄42岁,其中发热门诊387份,住院患者693份。本研究所收集发热呼吸道症候群病例纳入标准符合国家重大传染病防治科技重大专项传染病监测技术平台项目“发热呼吸道症候群监测技术方案”,采集病例信息时使用统一标准问卷(见附件1)。门诊患者发病时间按季节分为秋季(9月~11月)、冬季(第一年12月~第二年2月)、春季(3月~5月)和夏季(6月~8月);住院病房患者涵盖内科各系统疾病,以恶性血液病住院患者为主。临床诊断标准参考《内科学》(第8版)。1.咽拭子留取门诊患者均在当天留取咽试子样本,住院患者于入院时或首次发热的72h内采集咽拭子,咽拭子按照运输和保存规定严格操作。送检样本附送检单(见附件2)。样本预处理后,提取病毒核酸,核酸提取成功后进行检测。2.病毒及亚型检测使用Real-time PCR和普通PCR方法对呼吸道病毒及亚型进行检测。各病毒及亚型按照各自的引物探针、反应体系和扩增条件扩增,针对不同情况对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序。根据结果曲线、反应条带及测序结果对阳性结果进行判定。3.病毒及亚型检测结果分析通过分析呼吸道病毒检测结果,探讨8种呼吸道病毒及亚型构成比和检出率与时间的关系,呼吸道病毒检出率与性别、季节、年龄、住院时间等因素的关系,呼吸道病毒检出率与不同的呼吸道感染性疾病和其他原发病的关系,呼吸道病毒与其他病原体合并感染等情况,从而了解呼吸道病毒的流行趋势、易感因素和对疾病发生发展的影响。4.统计学方法采用SPSS 19.0软件对数据进行分析,计数资料采用例数和百分比,计数资料采用卡方检验,行列表卡方检验中两两比较时采用Bonferroni法校正检验水准,P<0.05为差异有统计学意义。实验方法实验结果1.第一部分发热呼吸道症候群患者呼吸道病毒病原学分布特征(1)8种呼吸道病毒及亚型检测结果共检测发热呼吸道症候群病人咽试子1080份,其中男性584份,女性496份,患者年龄在12~83岁之间,中位年龄42岁,共检出阳性样本429例,总检出率39.72%。单一病毒感染414例,IFVA阳性158例,IFVB阳性122例,RHV阳性45例,PIV-3阳性36例,h Co V阳性17例,RSVB阳性12例,ADV阳性8例,PIV-4和HMPV阳性各5例,HBOV阳性4例,PIV-1和RSVA阳性各1例,两种病毒混合感染15例。未出现三种及三种以上病毒混合感染。(2)不同月份、季节呼吸道病毒检出率的变化不同时间呼吸道病毒检出率不同,2016年3月检出率最高,为62.50%,2016年7月检出率最低,为18.75%,冬春季呼吸道病毒检出率明显高于夏秋季。(3)不同月份呼吸道病毒阳性构成比情况不同月份检出呼吸道病毒的种类和阳性构成比不同,分别检出4~9种不同的呼吸道病毒及亚型。(4)不同月份IFV检出率的变化、IFVA两种亚型构成比IFVA和IFVB最高检出率均为2016年3月,分别为26.04%和29.17%,IFVA最低检出率在2016年7月,为4.17%,IFVB最低检出率在2016年9月,为1.67%。2016年1月H3N2亚型构成比最高为75.00%,2016年7月和2016年10月无H3N2亚型检出。H1N1亚型趋势与H3N2亚型趋势相反。(5)PIV各亚型构成比和不同月份PIV检出率的变化PIV-3占全部PIV阳性样本的86.67%,PIV-2未检出。PIV-3在各月份均有检出,检出率最高在2016年6月,为6.67%,检出率最低在2015年12月,为1.45%。(6)不同时间RHV检出率的变化2016年11月检出率最高为7.81%,2016年1月检出率最低为2.27%,2016年6月和7月未检出RHV阳性样本。2.第二部分门诊发热患者呼吸道症候群病毒病原学分布特征(1)8种呼吸道病毒及亚型检测结果对发热呼吸道症候群门诊部分277例ARTI患者的咽拭子标本进行分析,共检出阳性样本138例,总检出率49.82%,单一病毒感染134例,IFVA阳性61例,IFVB阳性57例,RHV和PIV-3阳性各5例,h Co V阳性3例,ADV阳性2例,HMPV阳性1例,两种病毒混合感染4例,未出现三种及三种以上病毒混合感染。(2)性别与呼吸道病毒检出率的关系男性呼吸道病毒检出率为46.03%;女性检出率为52.98%,组间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)不同呼吸道感染疾病与呼吸道病毒检出率的关系急性上呼吸道感染检出率为51.63%,肺炎检出率为49.21%,急性支气管炎检出率为40.00%,组间差异无统计学意义(P>0.05)(4)季节与呼吸道病毒检出率的关系秋季检出率为29.51%;冬季检出率为66.67%;春季检出率为57.32%,夏季检出率为23.68%,冬春季呼吸道病毒检出率高于夏秋季(P<0.05)。(5)不同年龄段呼吸道病毒检测结果18~39岁检出率为47.62%,40~59岁检出率为56.19%,≥60岁检出率为36.00%。(6)不同月份IFV检出率的变化、IFVA两种亚型构成比IFV在2016年1月检出率最高,2015年9月和2016年7月、8月未检出IFVB,2016年2月H3N2亚型构成比最高为80.00%,部分月份无H3N2亚型检出,H1N1亚型趋势与H3N2亚型趋势相反。(7)临床血常规白细胞检查结果6名呼吸道病毒阳性结果患者NEUT%>70%,其余132名呼吸道病毒阳性结果患者NEUT%平均为(69.08±0.04)%。3.第三部分恶性血液病患者呼吸道感染病毒病原学分布特征(1)8种呼吸道病毒及亚型检测结果对发热呼吸道症候群恶性血液病患者部分361例咽拭子进行分析,共检出阳性样本98例,总检出率27.15%。IFVA阳性28例,其PIV-3阳性26例,RHV阳性24例,IFVB阳性9例,h Co V阳性6例,PIV-4阳性3例,RSVB阳性1例,PIV-3与RHV混合感染1例,未出现三种及三种以上病毒混合感染。(2)8种呼吸道病毒与HCMV、EBV复合感染情况98例呼吸道病毒检测结果阳性的患者中有12例与HCMV和(或)EBV复合感染,未出现2种及2种以上呼吸道病毒与HCMV和EBV共同感染。(3)呼吸道病毒与其他病原体合并感染情况单纯呼吸道病毒感染83例,与其他呼吸道病原体混合感染15例,其他病原体包括G-性杆菌、G+性球菌、支原体和真菌。(4)不同年龄段呼吸道病毒检测结果12~16岁呼吸道病毒阳性率为45.95%,17~59岁阳性率为22.30%,≥60岁阳性率为41.30%。12~16岁年龄组和≥60岁年龄组检出率显著高于17~59岁年龄组(P<0.05)。(5)不同原发病呼吸道病毒检测结果98例呼吸道病毒检测结果阳性患者中,急性髓系白血病患者所占比例最大。(6)住院天数与呼吸道病毒感染的关系≤7天组呼吸道病毒阳性率为11.21%,8~14天组阳性率为22.89%,15~28天组阳性率为34.52%,≥28天组阳性率为43.68%。不同住院时间呼吸道病毒感染率有差异(P<0.05),≥28天组呼吸道病毒感染率显著增高实验结论1.IFV是2015年9月~2016年12月期间引起发热呼吸道症候群患者发病的主要呼吸道病毒,冬春季为呼吸道病毒特别是IFV的高发季节,H3N2亚型检出比例较H1N1亚型高;2.呼吸道病毒是2015年8月~2016年9月发热门诊成人急性呼吸道感染患者的主要病原体;3.呼吸道病毒是2015年8月~2016年12月间引起恶性血液病患者急性呼吸道感染的主要病原体之一,易合并其他病原体感染;4.儿童和老年恶性血液病患者是呼吸道病毒的易感人群;5.住院时间延长是恶性血液病患者急性呼吸道感染的重要危险因素;6.不同恶性血液系统原发病患者的呼吸道病毒易感性不同;7.Real-time PCR法、PCR法能够快速准确检测呼吸道病毒。