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单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)简称单增李斯特菌,是一种自然界普遍存在的人畜共患病病原菌,也是一种食源性病原菌,它能引起人、畜的李斯特菌病。食品中存在的单增李斯特菌威胁着人类的安全,该菌在温度较低的环境中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。Lm-p60蛋白为单核细胞增生李斯特菌产生的一种胞外蛋白,由iap基因编码,与李斯特菌的致病性密切相关。Lm-p60蛋白具有酰胺水解酶的活性,能够水解细菌细胞壁,具有很高的研究价值。Lm-p60蛋白的三级结构预测及结构域功能的研究结果显示:Lm-p60蛋白存在着N端和C端两个独立的结构域,其中N端结构域存在两个LysM结构域和一个SH3结构域,而C端只含有一个NlpC/P60家族结构域。Lm-p60蛋白在裂解细菌细胞壁的过程中,只有N端结构域中的LysM和SH3具有结合底物功能,从而确定了 N端结构域行使识别并结合底物的功能,而C端结构域行使裂解底物功能。目前,Lm-P60蛋白是否具有抗菌性及抗菌效果如何还不是很清楚,而且Lm-p60蛋白在异源表达过程中还存在表达量不足和活性较低的问题。为了获得大量高活性Lm-p60蛋白,本研究通过SDS-PAGE分析比较不同载体构建的重组蛋白的表达量来确定最适表达载体,结果表明最适表达载体为pET30a。随后,本研究以SDS-PAGE分析和比浊法测重组蛋白裂解细菌细胞壁活性确定了以pET30a载体构建的重组蛋白最佳诱导表达条件是:在细菌培养至OD600值为0.553时加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,在摇床温度为30 ℃,转速为160 rpm条件下诱导培养4 h。然后通过SDS-PAGE分析和比浊法测裂解活性确定了最佳超声波破碎时间为20 min。在最佳条件下诱导表达并用镍柱亲和层析纯化Lm-p60蛋白,通过计算后Lm-p60蛋白的纯化倍数为1.2,回收率达95%。细菌抗药性及耐药性问题日益突出,开发新的抗菌剂十分迫切。Lm-p60蛋白具有裂解细菌细胞壁的活性,研究Lm-p60蛋白是否具有抗菌作用及抗菌效果如何成为一项重要的工作。本研究以溶壁微球菌为指示菌,琼脂打孔法确定了 Lm-p60蛋白具有抑菌活性,其抑菌效果比溶菌酶要弱。溶菌酶作为研究较为透彻的抗菌酶,其裂解细胞壁原理与Lm-p60蛋白有所不同,本研究发现,在溶菌酶中混合有Lm-p60蛋白后具有增强抑菌效果的重要结论。为溶菌酶的改造提供很好的材料。本研究还以pET30a载体构建Lm-p60蛋白的N端结构域与LysM2-C端重组蛋白。并通过比浊法测定发现N端结构域也具有裂解活性,但抑菌效果不明显,同时还发现只含有一个LysM结构域的C端重组蛋白裂解活性较弱。