罗氏沼虾作为一种重要的淡水虾养殖品种,也是我国主要的养殖虾类之一,不论是活虾还是虾仁,均是常见的日常食品。关于罗氏沼虾白尾病的研究,不仅与该虾养殖产业有关,而且跟消费者的食用安全也密切相关,水产动物源病毒的存在是否具有潜在危害,值得深入探究。本研究从罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)的致病性出发,一方面在结合现有诊断技术的基础上,构建出适合现场快速检测的便捷检测方法,研制针对MrNV病毒病原的实用化高灵敏性快速诊断试剂盒;另一方面采用反向遗传学技术构建MrNV和极小病毒(Extra small virus,XSV)的反向遗传载体,通过RNA干涉技术在细胞或活体水平上对XSV、MrNV的复制机制、致病性及XSV与MrNV的相互作用机制进行分析,为逐步阐明罗氏沼虾野田村病毒的致病机理、获得免疫抗原分子及药物治疗奠定基础;采用转录组学技术和差异蛋白质组学技术,对罗氏沼虾在MrNV/XSV胁迫下的差异表达基因和蛋白进行寻找、筛查和鉴定;构建一种虾类免疫增强剂体外高通量筛选方法和免疫效果评估技术,从动植物、真菌、细菌等中筛选适宜的抗病免疫增强剂。通过对MrNV/XSV致病机制和防控技术展开系统的研究,促进罗氏沼虾病原早期诊断和成虾上市前的病原筛查普及化,避免罗氏沼虾白尾病的发生,降低养殖风险,减少虾农的经济损失,同时有效地阻止携带病原的成虾流入市场,降低食用风险。具体研究内容如下:(1)罗氏沼虾野田村病毒快速诊断技术体系的构建针对罗氏沼虾野田村病毒MrNV和极小病毒XSV的衣壳蛋白基因,建立了罗氏沼虾白尾病的致病因子环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与侧向流层析检测试纸(Lateral flow dipstick,LFD)技术相结合的双重RT-LAMP-LFD快速检测方法,该方法能够在1小时内完成对单个样品的检测,灵敏度能够达到约1.0pg,是常规RT-PCR的100倍;针对弱毒情况,根据核酸依赖性扩增技术(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)原理建立了MrNV的NASBA反应体系,再经过筛选研究,利用生物素探针标记的核酸检测试纸来检测NASBA反应产物。MrNV-NASBA-LFD方法反应时间需要2小时左右,在时效上低于LAMP方法,但是它的灵敏度能达到1.0 fg左右,是常规RT-PCR的10~4倍,而且相对于LAMP方法,不易出现假阳性和二次污染,但是相比之下成本高很多,大约是LAMP方法的2倍多。同时,完成了罗氏沼虾野田村病毒体外诊断试剂盒的设计和装配。依据两种检测技术研制的诊断试剂盒,可以根据不同的需要进行选择。(2)罗氏沼虾野田村病毒衣壳蛋白的原核表达和抗体的制备通过RT-PCR获得MrNV的衣壳蛋白CP43的全长基因组cDNA,再通过诱导表达与纯化获得目的蛋白,制备了多克隆抗体。该抗血清经过Western blot验证,特异性较强,被用于在sf9细胞中进行亚细胞定位观察。(3)MrNV与XSV在不同龄罗氏沼虾中的转录与表达通过荧光定量PCR、免疫荧光、超薄组织切片、RNA干涉等方法分析了在细胞和活体水平上MrNV与XSV的的转录和表达情况。发现在感染早期XSV的表达水平明显高于MrNV,在成虾的各个组织中均能检测到目的基因,不过在血淋巴、肝胰腺、肌肉组织中相对表达量较高;组织病理和超薄组织切片试验都表明病毒颗粒以包涵体的形式存在于组织中,对机体细胞和纤维组织造成破坏,导致病变发生。在细胞sf9中进行主病毒与卫星病毒的干涉试验,采用荧光定量PCR实验验证,结果表明进行MrNV编码聚合酶基因RNA1沉默的情况下,会导致XSV复制抑制;而编码衣壳蛋白基因RNA2沉默时,XSV复制无明显影响;对XSV衣壳蛋白CP干涉时则对MrNV复制无显著性影响。(4)MrNV/XSV-chin感染罗氏沼虾苗的转录组学研究对病毒感染前后罗氏沼虾幼体进行转录组学研究,完成2两组样本,每组3个生物学重复的转录组测序,其中原始Clean Data约40.67 Gb,各样品的数据量均在6.16 Gb以上,错误率低于0.1%的碱基在92.56%及以上。通过Unigene的拼接和功能注释,Unigene一共97,770条,其中有16,990条在1 kb以上。对Unigene的功能进行注释,通过KEGG、COG、Swiss-Prot和GO等多个数据库的比对,获得了17,428条注释Unigene的结果。对Unigene数据进行基因结构分析,获得14,854个SSR标记。对各基因表达量进行统计分析,根据表达量的差异,筛选出样本间差异表达基因161个,其中上调基因30个,下调基因131个。根据差异表达基因的生物信息学注释,挑选了可能参与各种代谢和免疫途径的50基因进行了荧光定量PCR验证,其中上调仅9个,下调基因41个,相对表达量与预测基本吻合。(5)MrNV/XSV-chin感染罗氏沼虾苗的蛋白质组学研究利用传统双向电泳技术,对比感染病毒后7天有症状的罗氏沼虾幼苗和其阴性对照,筛选到显著性差异蛋白35个,挑选这些蛋白点进行质谱鉴定分析,最后成功完成鉴定蛋白点19个。将质谱图跟蛋白数据库进行比较分析,其中可以依据氨基酸序列设计出可用引物的有13个,在NCBI蛋白数据库中比对到的这13个蛋白序列,氨基酸覆盖率都非常低,最高的为33%,最低的仅2%。荧光定量PCR验证结果表明,这13个基因序列,在攻毒后表达显著上调有10个,显著性下调的基因只有3个,在表达水平上均存在显著性差异。(6)罗氏沼虾抗病免疫增强剂的筛选与效果评估以罗氏沼虾的非特异性免疫指标为基础,构建了一种快速高通量筛选免疫增强剂的方法,利用罗氏沼虾血淋巴细胞进行初筛,在此基础上研制了对罗氏沼虾抗病生长可能具有一定效果的免疫增强剂组合配方,再通过投喂后实际评估罗氏沼虾的生长速率、存活率等初步进行免疫增强剂的效果评估。同时,通过筛选与免疫相关的microRNA分子,完成了罗氏沼虾与免疫相关的microRNA的筛选,成功获得了3个microRNA分子(bta-mir-2478、mu-mir-3968和has-mir-7975)可以用于免疫效果的评估,从而证明了高通量筛选免疫增强剂的方法可行性。