论文部分内容阅读
肝细胞癌（HCC）是一种非常常见的原发性恶性肝肿瘤。尽管我们在HCC治疗方面取得的很多进展,但HCC的长期生存率仍然很低,主要的原因是,大多数患者在晚期才被发现。因此,探索HCC的发生、进展、侵袭和转移的分子机制、寻找新的生物标志物对HCC的早期诊断和治疗至关重要。长链非编码RNA（long non-coding RNA,Lnc RNA）可在疾病的发生发展中发挥重要的作用,在HCC中许多Lnc RNAs差异表达,并且这些差异表达的Lnc RNA与HCC发生发展密切相关,可作为肝癌诊断,治疗反应耐药,预测复发及预后等方面的标志物。近年来的多项研究表明,Lnc RNA可以作为竞争性内源性RNA（ce RNA）,在HCC中发挥重要作用。DSCAM-AS1可能在HCC的生物学过程中发挥作用。mi R-124有影响肝细胞癌增殖的作用,可能与DSCAM-AS1相互作用影响肝癌的增殖。长链非编码RNA ADAM金属肽酶与9反义RNA2（ADAMTS9-AS2）参与多种类型的癌症的发生发展包括肝癌。探讨Lnc RNA DSCAM-AS1与Lnc RNA ADAMTS9-AS2在肝细胞癌中可能的作用机制,为肝细胞癌的诊断及治疗提供理论支持。本研究分以下四部分:第一部分Lnc RNADSCAM-AS1与mi R-124在肝细胞癌中的表达差异及临床意义目的:观察Lnc RNADSCAM-AS1与mi R-124在肝细胞癌中的表达水平及差异表达的临床意义。方法:1.采用定量聚合酶链反应法测量Lnc RNA DSCAM-AS1和mi R-124在HCC组织中的表达水平。2.采用皮尔逊相关系数分析DSCAM-AS1和mi R-124在HCC组织中的表达相关性。3.采用One-way ANOVA结合Tukey检验,分析不同分期患者HCC组织中DSCAM-AS1和mi R-124表达水平的差异。结果:1.与非肿瘤组织相比,HCC组织中DSCAM-AS1的表达水平显著升高;相反,HCC组织中mi R-124在HCC组织中的表达水平明显低于非肿瘤组织。2.HCC组织样本中,DSCAM-AS1的表达水平与mi R-124的表达水平呈显著负相关,而在非肿瘤组织中DSCAM-AS1与mi R-124的表达水平之间没有相关性。3.随着临床分期的增加,DSCAM-AS1的表达水平显著升高,而mi R-124的表达水平显著降低。HBV和HCV感染对DSCAM-AS1和mi R-124的表达水平没有显著影响。小结:1.DSCAM-AS1和mi R-124在HCC组织中存在表达差异。2.DSCAM-AS1和mi R-124在HCC组织中的表达呈负相关。3.DSCAM-AS1和mi R-124的表达受临床分期的影响,但不受HBV和HCV感染的影响。第二部分Lnc RNA DSCAM-AS1与mi R-124负调控促进肝癌细胞的增殖目的:研究DSCAM-AS1和mi R-124在肝癌细胞中的相互作用及对肝癌细胞增殖的影响。方法1.用DSCAM-AS1表达载体或mi R-124mimic转染SNU-449和SNU-398细胞,分析DSCAM-AS1与mi R-124之间的相互作用。2.采用CCK-8法分析转染后对SNU-449和SNU-398细胞增殖的影响。3.应用Inta RNA在线程序预测DSCAM-AS1与mi R-124之间的直接相互作用。RNA-RNA pulldown实验证实它们之间的直接相互作用。结果:1.过表达DSCAM-AS1显著下调了mi R-124,此外,mi R-124过表达也下调了DSCAM-AS1。2.与正常对照组相比,过表达mi R-124抑制SNU-449和SNU-398细胞增殖,而过表达DSCAM-AS1促进SNU-449和SNU-398细胞增殖。过表达DSCAM-AS1降低了mi R-124过表达的影响。3.预测显示,DSCAM-AS1与mi R-124之间可能形成一个很强的碱基配对。RNA-RNA pulldown实验显示,与NC组相比,DSCAM-AS1下拉组的mi R-124水平显著升高,证实了它们之间的直接相互作用。小结:1.DSCAM-AS1和mi R-124在HCC细胞中相互负调控。2.DSCAM-AS1和mi R-124之间的相互作用参与调控HCC细胞的增殖。3.DSCAM-AS1与mi R-124之间存在直接的相互作用。第三部分Lnc RNA DSCAM-AS1在肝细胞癌中参与的ce RNA调控机制目的:用生物信息学的方法构建lnc RNA-mi RNA-m RNA-pathway的调控网络,后续重点关注靶向m RNA及增殖相关的通路。方法:1.下载UCSC TCGA LIHC的level3 RNA-seq数据同时提取临床信息。2.利用limma包提供的经典贝叶斯方法对肿瘤（Tumor）和癌旁（Normal）的m RNA进行差异分析,获得差异表达的基因。3.把利用mi RDB、Targetscan7.2预测的mi RNA-m RNA关系对与差异表达获得的mi R-124-3p可以调控的靶基因进行整合,获得的关键基因使用DAVID 6.8工具进行KEGG PATHWAY分析。4.利用以上获得的mi RNA-m RNA关系对,筛选DSCAM-AS1-mi RNA-m RNA-pathway关系对,使用cytoscape 3.6.1软件进行网络构建。5.基于在线工具GEPIA工具对ce RNA中的关键m RNA进行表达和预后分析。结果:1.对TCGA的m RNA进行差异表达分析,选择|log FC|＞1＆adj.P＜0.05阈值筛选出差异表达基因,一共1283个。2.整合后最终获得的mi R-124-3p在肝癌中显著调控的78个靶基因。3.ce RNA网络包括1个lnc RNA,1个mi RNA,78个m RNA。4.ce RNA中的m RNA主要参与增殖、凋亡、癌症相关通路。比如增殖相关的通路有cell cycle通路（CDK4、ANAPC7）,PI3K-AKT通路（CDK4,COL4A1,LAMC1等）,MAPK通路。5.ANAPC7在HCC中高表达,与患者的总生存期（OS）与无病生存期（DFS）DFS呈负相关;CDK4在HCC中高表达,与患者的OS与DFS呈负相关。小结:通过生物信息学的方法构建了Lnc RNA DSCAM-AS1/mi R-14-3p/ANAPC7、CDK4/cell cycle网络,预测了DSCAM-AS1对于肝细胞癌增殖表型可能的作用机制。第四部分Lnc RNA ADAMTS9-AS2在肝细胞癌中参与的ce RNA调控机制目的:用生物信息学的方法构建lnc RNA-mi RNA-m RNA-pathway的调控网络,后续重点关注靶向m RNA及增殖相关的通路。方法:1.从UCSC Xena数据库下载肝细胞癌（LIHC）的gene expression RNA-seq表达矩阵数据（m RNA/lnc RNA）,同时下载成熟的mi RNA表达矩阵数据及样本临床表型数据和生存信息。RNA-seq数据根据GENCODE提供gtf基因注释文件对这些基因进行注释,mi RNA数据利用mi RBase数据库对成熟的mi RNA ID进行转化。2.ADAMTS9-AS2采用T检验进行差异表达分析;ADAMTS9-AS2与临床因素的关联性分析采用卡方检验;ADAMTS9-AS2的表达值与样本的预后信息,采用Kaplan-Meier生存分析方法,使用Logrank检验计算显著性P值。3.利用limma包提供的经典贝叶斯方法对肿瘤（Tumor）VS癌旁（Normal）的m RNA以及mi RNA进行差异分析。4.利用本地GSEA软件以KEGG pathway基因集合作为富集背景进行功能富集及通路分析。5.分别计算ADAMTS9-AS2和差异m RNA的Pearson相关系数,进行相关性检验共表达分析获得Lnc RNA与m RNA关系对。6.基于共表达网络Lnc RNA-m RNA中的m RNA及差异mi RNA,利用mi RWalk2.0工具,综合mi RWalk、mi Randa、RNA22、Targetscan这4个常用数据库中的结果,选取最终的mi RNA-m RNA关系对。7.利用以上获得的mi RNA-m RNA和ADAMTS9-AS2-mi RNA关系对进行网络构建,使用Cytoscape插件Cyto NCA进行节点连接度（degree）分析。8.利用在线数据库metascape对网络中m RNA进行GO BP和KEGG pathway富集分析。结果:1.ADAMTS9-AS2在正常和癌症组之间差异不显著,采用亚组进行分析显示在男性病人、G1期、M0期、T1、T3、T4期、肿瘤I、II级中ADAMTS9-AS2在HCC中的表达对比正常组是存在差异的。2.在所有癌症样本中ADAMTS9-AS2与预后关系不显著,因此我们分别绘制了ADAMTS9-AS2在早期样本（stage i-ii）和晚期样本（stage iii-iv）中K-M生存曲线,结果显示,采用最佳临界值分组,早期及晚期样本中ADAMTS9-AS2的表达与预后关系显著。3.正相关KEGG pathway包含有36个,负相关KEGG pathway包含有8个,正相关排名第一的通路为肥厚性心肌病,负相关排名第一的通路为类固醇代谢通路。4.共得到124个ADAMTS9-AS2-m RNA共表达关系对,得到14个ADAMTS9-AS2-mi RNA关系对,78个mi RNA-m RNA关系对,ce RNA网络包括1个lnc RNA,9个mi RNA,11个m RNA。5.对网络中m RNA进行功能富集分析,共得到8个GO BP富集结果,排名第一的富集结果显示为细胞与细胞粘附的负调节。小结:通过生物信息学分析,我们预测了3条ADAMTS9-AS2参与的ce RNA网络:ADAMTS9-AS2/mi R-10b-5p/DUSP5/MARK信号通路;ADAMTS9-AS2/mi R-9-3p、mi R-500a-5p、mi R-501-5p、mi R-452-5p/LIFR/JAK-STAT信号通路;ADAMTS9-AS2/mi R-182-5p、mi R-196b-5p/CXCL12/NF-kappa B信号通路。结论:1.DSCAM-AS1和mi R-124可以相互负调控其表达来调控HCC细胞的增殖。2.通过生物信息学的方法构建了Lnc RNA DSCAM-AS1/mi R-14-3p/ANAPC7、CDK4/cell cycle网络,预测了DSCAM-AS1对于肝癌增殖表型可能的作用机制。3.通过生物信息学分析,我们预测了3条ADAMTS9-AS2参与的ce RNA网络:ADAMTS9-AS2/mi R-10b-5p/DUSP5/MARK信号通路;ADAMTS9-AS2/mi R-9-3p、mi R-500a-5p、mi R-501-5p、mi R-452-5p/LIFR/JAK-STAT信号通路;ADAMTS9-AS2/mi R-182-5p、mi R-196b-5p/CXCL12/NF-kappa B信号通路。