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由柑橘绿霉病菌(Penicillium digitatum)引起的柑橘绿霉病是采后柑橘腐烂的重要因子,造成的采后损失约占全部损失的90%,然而对该病菌的致病、抗药的分子机制知之甚少。对感兴趣的基因进行敲除是研究该基因功能的必要途径。虽然我们已建立了农杆菌介导柑橘绿霉病菌遗传转化体系,但应用该体系敲除基因的频率低下,对有些基因甚至无法实现敲除,以致该病菌基因功能研究的进程缓慢。本论文报道了：1.一种高效的柑橘绿霉病菌基因敲除体系的构建；2.柑橘绿霉病菌C-5甾醇去饱和酶基因PdErg3B的功能,结果如下：1.一种高效的柑橘绿霉病菌基因敲除体系的构建低效率的基因敲除与丝状真菌存在活跃的非同源末端链接(Non-homologous end joining, NHEJ)的DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DBSs)修复途径有关,而蛋白Ku70和Ku80构成的异聚体是NHEJ途径的关键因子。本研究应用米曲霉(Aspergillus oryzae)的Ku80同源基因AoKu80到本实验室完成测序的柑橘绿霉病菌基因组数据库中进行同源搜索,比对发现该病菌存在一个Ku80同源基因,命名为PdKu80。PdKu80基因全长2673bp,含10个内含子,编码712个氨基酸。通过两步PCR和基因克隆技术将潮霉素抗性基因元件替换PdKu80基因编码序列,构建PdKu80缺失的质粒pTFCM-△PdKu80,再在农杆菌介导下将pTFCM-△PdKu80导入柑橘绿霉病菌的基因组,在含潮霉素培养基上筛选出82个转化子。经PCR和Southern blot验证,发现其中3个转化子为PdKu80缺失,且无pTFCM-△PdKu80随机插入的突变体(△PdKu8)。表性分析表明△PdKu80的营养生长、产孢和致病力与野生型菌株基本一致。以同样的方法构建PdBrlA缺失的质粒pNEO1300-△PdBrlA, PdMpkA缺失的质粒pNE01300-△PdMpkA,在农杆菌介导下分别将这两个质粒转化野生型菌株PdKH8和APdKu80,在含新霉素培养基上筛选转化子,转化子经PCR鉴定确定,结果发现以PdKH8为受体菌株时,PdBrlA和PdMpkA的敲除频率分别为2.2%和4.0%,而以△PdKu80为受体菌株时,PdBrlA和PdMpkA的敲除频率分别为33.3%和13.0%。可见使用△PdKu80为受体菌株,可提高柑橘绿霉病菌的基因敲除频率。2.PdErg3B基因功能研究柑橘绿霉病菌中存在两个烟曲霉C-5甾醇去饱和酶基因PdErg3A、PdErg3B。 PdErg3A基因全长939bp,编码312个氨基酸,不含内含子；PdErg3B基因全长1130bp,编码350个氨基酸,在nt271与nt347之间存在一个长为77bp的内含子。通过缺失PdErg3B不影响柑橘绿霉病菌的菌丝生长、产孢和麦角甾醇的合成,但提高了病菌对抑霉唑、苯醚甲环唑、戊唑醇等DMI类杀菌剂的抗性。可见PdErg3B与柑橘绿霉病菌的营养生长、产孢和麦角甾醇合成无关,而与DMI杀菌剂的抗性有关。