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维吉尼亚链霉菌IBL14 (Streptomyces virginiae IBL14)属于放线菌属,它能转化并降解甾醇类化合物,为本实验室自行分离纯化得到。由IBL14全基因组序列分析可知,其染色体中存在与CRISPR-Cas Ⅰ型系统相关的蛋白,还存在能够水解青霉素的p-内酰胺酶(β-lactamase)基因及一系列产青霉素基因簇的代谢途径。构建青霉素重组菌株就是利用IBL14本身的CRISPR-Cas Ⅰ-SV14B型系统对其中三种直接影响青霉素产量的酶进行插入、敲除、点突变及多种组合,这三种酶分别是：青霉素酰胺酶基因(sviPA)、异青霉素-N异构酶基因(sviIPI)和β-内酰胺酶基因(sviLT)。青霉素是应用极为广泛的一类抗菌素,疗效高且毒性低,主要治疗G+菌所导致的感染,已被大量生产以满足需求,目前市面上获得青霉素的高产菌株主要是通过诱变育种、细胞工程等方法,本实验通过对上述三种酶的基因改造来预期实现提高IBL14中青霉素产量的目的。研究表明,在细菌和古生菌中存在着一类重复结构,被称为规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR),即CRISPR。CRISPR位点是由一系列高度保守的正向重复序列(repeats)和间隔序列(spacer)排列组成的多段R-S结构,位点附近存在一系列CRISPR相关蛋白(CRISPR association protein, cas protein),位点上游存在前导序列(leader sequence),它们共同作用形成一种特殊的防御系统即CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统是指在RNA的指导下降解外源入侵的噬菌体或病毒的一种适应性免疫系统,可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,目前,Ⅱ型CRISPR-Cas系统应用技术最为成熟。该系统主要通过抵御外界各种基因原件的干扰,来实现微生物的自我保护,具体过程可分为3个阶段：适应、表达和干扰。它是一种全新的技术,克服了传统技术的一些缺点,它更加高效、更加简便、更加容易操作。本论文首先应用IBL14自身的CRISPR-Cas Ⅰ-SV14B型系统对其中影响青霉素产量的三个基因进行改造。已知在IBL14染色体中存在CRISPR-Cas Ⅰ型系统相关蛋白,只需再进行编辑模板片段(editing templets)和靶向基因片段(target constructs)的设计,构建出含有向导RNA(single guide RNA)和基因编辑模板的敲除质粒,转化到IBL14原生质体中,筛选得到敲除后的重组子,对重组子染色体进行分析和验证,结果显示PCR产物条带已经减少为预期的大小,对PCR产物进行测序分析结果显示均与敲除后条带序列一致,说明基因已被成功敲除,该方法有利于IBL14体内影响青霉素产量其他相关基因的改造。目前有关CRISPR-Cas Ⅱ型技术的应用最为成熟,为了将Ⅱ型CRISPR-Cas技术最终应用到IBL14的基因改造中,并对比CRISPR-Cas Ⅰ型技术与CRISPR-Cas Ⅱ型技术的异同,现将外源的CRISPR-Cas Ⅱ型系统首先应用到模式生物大肠杆菌的蓝白斑筛选作用中的变旋酶基因即galM基因中,对该基因进行改造。在该基因敲除过程中,Cas9蛋白必不可少,该基因成功敲除后会有大肠杆菌白色菌落出现,PCR后对产物进行测序分析,结果显示该基因已成功敲除,说明通过CRISPR-Cas Ⅱ型系统对基因进行改造的技术在本实验室也已步入正轨,但目前两种技术均处于初级阶段,利用该技术首先实现了基因的改造,也为CRISPR-Cas Ⅰ型系统和CRISPR-Cas Ⅱ型系统在本实验室的应用提供了良好的基础。