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自古以来天然中草药在我国有着广泛的使用,国家十分重视对传统中草药的研究,在早期对中草药提取成分进行高通量的筛选是实现中药现代化的新课题。中草药成分复杂,大都以口服给药途径为主,研究其在胃肠道的吸收显得尤为重要。近几十年来,人们对转运体进行了深入研究,对这些蛋白的作用和分子机制有了新的认识,其中以P-糖蛋白最受关注。人类P-糖蛋白由位于第7条染色体上的ABCC1基因编码,是ATP结合盒(ATP bindingcassette,ABC)转运蛋白超家族成员之一。P-糖蛋白具有ATP酶活性,利用水解ATP释放的能量将药物泵出细胞外。P-糖蛋白在正常人体的小肠有着丰富的表达,它能限制药物的摄取,是影响药物体内药代动力学的重要因素。确定化合物是否是P-糖蛋白的底物,对于研究该化合物的药代动力学十分重要。目前常用的研究方法有以下几种：顶部表达P-糖蛋白极化细胞单层细胞药物转运模型,如Caco-2细胞模型；高表达P-糖蛋白极化细胞单层细胞药物转运模型,如LLC—PK1/MDR1和MDCKII/MDR1细胞模型；高表达P-糖蛋白细胞的药物摄取；如Bcap37/MDR1细胞模型；富含P-糖蛋白的细胞囊膜与药物的直接作用。
娑罗子是欧洲七叶树、日本七叶树和中国天师栗的果实。七叶皂苷是从娑罗子中分离出来的一种重要组分,属于三萜皂苷类的化合物。七叶皂苷具有消炎、抗渗出、增加静脉张力、改善血液循环以及纠正脑功能失常等作用,临床应用广泛。但是,七叶皂苷在人体内的生物利用度不高。研究发现,七叶皂苷能抑制P-糖蛋白活性。药物对药物转运体活性的影响,是导致药物相互作用的主要因为之一。为了最大限度地减少因药物相互作用而导致的药物不良反应,指导临床合理用药,研究已知药物对药物转运体活性的影响具有重要的临床意义。基于以上研究背景,本课题旨在研究七叶皂苷对P-糖蛋白在体外和体内产生的影响及其临床意义。通过考察七叶皂苷对P-糖蛋白功能的影响以及P-糖蛋白对七叶皂苷跨膜转运的影响,探讨药物与P-糖蛋白的相互作用,并进一步通过严格设计的临床实验,以他林洛尔为探药,基于转运体的遗传多态性对其功能的影响,在整体药代动力学水平和药物相互作用层面探讨七叶皂苷对P-糖蛋白活性的影响,为临床上药物相互作用及个体反应差异提供分子水平的解释,并为临床实施中西药合理运用和基因导向性个体化用药提供指导。本研究主要内容及结果如下：
⑴稳定表达MDR1-LLC-PK1细胞平台的建立全长的MDR1 cDNA片段经过酶切与真核表达载体pcDNA3.1(-)相连,酶切和DNA测序确认表达载体构建正确。质粒pcDNA3.1/MDR1通过Lipo2000转染LLC-PK1细胞,经G418筛选得到抗性单克隆。所建立的稳定表达MDR1的LLC-PK1细胞和空转载体pcDNA3.1(-)的LLC-PK1细胞相比,实时荧光定量RT-PCR发现MDR1的mRNA表达明显升高；western blot表明,P-糖蛋白的表达发生了从无到有的变化；激光共聚焦显示,P-糖蛋白定位于LLC-PK1/MDR1细胞膜上；药敏实验结果显示,LLC-PK1/MDR1对秋水仙素的敏感性远低于对照细胞。
⑵MTT试验结果显示100μM七叶皂苷及50μM维拉帕米对细胞无毒性,细胞活性>90％；七叶皂苷和维拉帕米不会激发或淬灭荧光,不对实验造成干扰；60分钟内,细胞对罗丹明123的摄取最快；1-50μM七叶皂苷对P-糖蛋白介导的罗丹明123外排有显著抑制作用(P<0.05),且呈剂量依赖性,50μM七叶皂苷使细胞内荧光强度增加123％；七叶皂苷可以抑制P-糖蛋白功能,但其抑制效果较维拉帕米弱,50μM七叶皂苷的抑制效果约为50pM维拉帕米的30％。
⑶反向高效液相-质谱检测LLC-PK1/MDR1细胞内七叶皂苷的方法学建立。流动相乙腈:10mM甲酸铵=40:60(V/V；含0.2％甲酸)；流速1.0mL/min；柱温40℃；检测波长203nm。采用电喷雾电离正离子模式(ESI+),毛细管电压3.1kV,去溶剂气温度400℃,离子源温度119℃。七叶皂苷在0.039-20μg/mL,范围内线性良好,七叶皂苷的萃取回收率大于80.6％,三个浓度的日内、日间差均小于17％,最低定量限为O.039μg/mL。七叶皂苷在37℃下细胞的摄取量随浓度的增加而增加,然而通过比较药物浓度与摄取量的关系,发现七叶皂苷的摄取曲线是直线,反映了药物的吸收可能是被动扩散过程。同时,在药物转运实验中发现,随着药物浓度的变化,药物的表观渗透系数(Papp)保持稳定,进一步证实药物的吸收是被动扩散。
⑷采用他林洛尔作为探药,在不同MDR1基因型个体研究了七叶皂苷对人体P-糖蛋白转运活性的影响。连续服用14天七叶皂苷后,他林洛尔AUC(0～36)增加了54.7％,AUC(0～∝增加了56.4％,Cmax增加了35.0％,而达峰时间tmax和半衰期t1/2没有发生显著改变。七叶皂苷显著增加他林洛尔的血药浓度,提示七叶皂苷在人体内抑制了P-糖蛋白转运活性。
⑸综合以上实验结果,得到如下结论：①成功构建稳定高表达P-糖蛋白的LLC-PK1细胞平台,P-糖蛋白定位准确,具有功能意义。②七叶皂苷对P-糖蛋白具有功能抑制作用,其抑制程度约为同剂量维拉帕米的30％。③P-糖蛋白不参与七叶皂苷摄取与转运,其作为P-糖蛋白底物特征不明显。④七叶皂苷显著增加体内他林洛尔血药浓度,其在体内可能通过抑制P-糖蛋白而增加他林洛尔的摄入,但是这种作用可能与P-糖蛋白的基因型无关。提示临床上七叶皂苷与P-糖蛋白底物药合用时,可能会有药物相互作用发生,七叶皂苷可能会增加P-糖蛋白底物药在体内的浓度,从而增加疗效或使毒性作用更强。