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维生素D缺乏症在孕妇和儿童中尤其普遍,已成为全球范围的重大公共卫生问题。孕妇维生素D缺乏与不良妊娠结局有关。此外,妊娠期维生素D缺乏增加后代哮喘和多发性硬化症的风险。最近,我们的研究结果表明,生命早期维生素D缺乏症扰乱了小鼠的睾丸发育和精子发生。然而生命早期维生素D持续缺乏对中年小鼠前列腺增生和前列腺癌进展的影响及其机制尚不清楚。本课题通过体内外研究探讨生命早期维生素D持续缺乏对中年小鼠前列腺增生和前列腺癌进展的影响和部分机制。通过构建生命早期维生素D持续缺乏的ICR小鼠模型,探讨生命早期维生素D持续缺乏对中年小鼠慢性前列腺炎症和前列腺增生的影响,并探明NF-kB和STAT3信号在其中所起的作用;通过构建生命早期维生素D持续缺乏的自发前列腺癌转基因(TRAMP)小鼠模型,探讨生命早期维生素D持续缺乏对中年小鼠前列腺癌生长和转移以及前列腺组织NF-kB和STAT3信号的影响。为了进一步验证NF-kB和STAT3信号激活在前列腺癌进展中的作用及维生素D的保护效应,我们观察了活性维生素D补充对炎症介导的前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并探讨活性维生素D对NF-kB和STAT3信号的抑制作用。初步阐明生命早期维生素D持续缺乏对中年小鼠前列腺增生和前列腺癌进展的影响和部分机制,为寻求前列腺增生和前列腺癌的病因及防治策略提供理论依据。研究一、生命早期维生素D持续缺乏对中年小鼠前列腺增生的影响目的:探讨生命早期维生素D持续缺乏对中年小鼠前列腺增生的影响及其机制。方法:将ICR孕鼠随机分成两组:标准饲料喂养组(Control组)和维生素D缺乏饲料喂养组(VDD组)。在Control组中,母鼠在整个妊娠和哺乳期间用标准饲料(含1000 IU维生素D3/kg)喂养。3周断奶后,雄性仔鼠继续用标准饲料喂养37周。在VDD组中,母鼠在整个妊娠和哺乳期间用维生素D缺乏饲料(含0 IU维生素D3/kg)喂养。断奶后,雄性仔鼠随机分成两组。在VDD组中,仔鼠继续用维生素D缺乏饲料喂养37周。在VDS组中,雄性仔鼠先用维生素D缺乏饲料喂养17周,然后换成标准饲料继续喂养20周。三组仔鼠于40周龄时剖杀。收集血清检测25(OH)D水平。收集前列腺组织用于蛋白质免疫印记和RT-PCR检测或4%多聚甲醛固定后用于组织学检查和免疫组织化学分析。结果:在VDD组小鼠中观察到前列腺重量增加和前列腺增生,且VDD组小鼠前列腺Ki67阳性上皮细胞(增殖标志物)的数量增加。进一步分析发现维生素D缺乏促进中年小鼠前列腺组织炎性细胞浸润和基质纤维化。此外,维生素D缺乏激活中年小鼠前列腺组织NF-κB信号,上调前列腺Il-6 m RNA表达并导致STAT3激活。有趣的是,当用标准饲料替换维生素D缺乏饲料喂养时,维生素D缺乏引起的前列腺炎症和增生可被部分逆转。结论:生命早期维生素D持续缺乏通过加剧局部炎症促进中年小鼠前列腺增生。研究二、生命早期维生素D持续缺乏对中年小鼠前列腺癌进展的影响目的:探讨生命早期维生素D持续缺乏对中年小鼠前列腺癌生长和转移的影响。方法:为了探讨生命早期维生素D持续缺乏对中年小鼠前列腺癌生长和转移的影响,我们构建了生命早期维生素D持续缺乏的TRAMP小鼠模型。3周龄雄性TRAMP小鼠随机分成两组:Control组和VDD组。Control组小鼠用标准饲料喂养,VDD组小鼠用维生素D缺乏饲料喂养。两组小鼠于28周龄时剖杀。收集血清检测25(OH)D水平;收集前列腺组织称重并用于蛋白质免疫印记检测或4%多聚甲醛固定后用于组织病理学检查。淋巴结和肾脏组织以及肺脏(左叶)和肝脏(左叶),用H&E染色病理切片检测肿瘤转移灶。结果:与Control组相比,VDD组中年TRAMP鼠前列腺重量和系数显著增加,且前列腺基质增厚。更为重要的是,VDD组小鼠总转移和肺转移发生率显著升高。此外,维生素D缺乏上调中年TRAMP鼠前列腺组织NF-κB和STAT3信号。结论:生命早期维生素D持续缺乏促进中年TRAMP鼠前列腺癌生长和转移,NF-kB和STAT3信号可能在该过程中发挥重要作用。研究三、活性维生素D补充对炎症诱导的前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响目的:进一步验证NF-kB和STAT3信号激活在前列腺癌进展中的作用及维生素D的保护效应。方法:将PC-3细胞分成四组:对照组(Control组)、1,25(OH)2D3单独处理组(VD3组)、LPS单纯处理组(LPS组)及1,25(OH)2D3和LPS联合处理组(VD3+LPS组)。VD3组和VD3+LPS组细胞在LPS(2.0 mg/ml)给药前12和2 h给予1,25(OH)2D3(100 nmol/L)两次预处理,于LPS处理后不同时间点收集培养上清和细胞,用于后续实验。具体由以下五个实验组成:实验1,为了验证1,25(OH)2D3能否激活PC-3细胞VDR信号,于LPS处理后6 h收集各组细胞,用RT-PCR检测VDR靶基因Cyp24A1 m RNA表达水平。实验2,为了探讨1,25(OH)2D3对LPS介导的PC-3细胞增殖的影响,于LPS处理后6 h收集细胞。(1)收集的细胞经70%乙醇固定后,用Muse细胞分析仪检测细胞周期。(2)收集的细胞提取核蛋白后,用蛋白质免疫印记检测Cyclin D1和PCNA蛋白水平。实验3,为了探讨1,25(OH)2D3对LPS介导的PC-3细胞迁移和侵袭的影响,细胞于LPS处理后12 h用Transwell迁移实验检测各组细胞迁移能力;于LPS处理后48 h用Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力;于LPS处理后6 h收集细胞,用RT-PCR技术检测基质降解相关酶MMP3、MMP9和u PA m RNA表达水平。实验4,为了探讨1,25(OH)2D3对LPS介导的PC-3细胞炎性因子、趋化因子和粘附分子表达的影响,于LPS处理后6 h收集细胞。用RT-PCR检测炎性因子TNF-a、IL-1a、IL-1b、COX-2和IL-6 m RNA表达水平,用ELISA检测培养上清IL-6水平;用RT-PCR检测趋化因子IL-8和MCP-1 m RNA水平,用ELISA检测培养上清IL-8水平;用RT-PCR检测粘附分子ICAM1 m RNA水平。实验5,为了探讨1,25(OH)2D3抑制LPS诱导的PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的机制,上述四组细胞于LPS处理后6 h收集。用蛋白质免疫印记检测NF-kB(胞浆蛋白p I-kB/I-kB、核蛋白p50和p65)、AKT(胞浆蛋白p-Akt/Akt)、MAPK(胞浆蛋白p-p38/p38)和STAT3(胞浆蛋白p STAT3/STAT3和核蛋白p STAT3)信号相关蛋白水平。结果:实验1结果显示:1,25(OH)2D3处理可显著激活PC-3细胞VDR信号,但LPS对1,25(OH)2D3激活的VDR信号无抑制作用。实验2结果显示:1,25(OH)2D3预处理可显著抑制LPS上调的PC-3细胞S期细胞比例,及核Cyclin D1和PCNA蛋白水平。实验3结果显示:1,25(OH)2D3预处理可抑制LPS增强的细胞迁移和侵袭能力,以及MMP3、MMP9和u PA m RNA表达水平。实验4结果显示:LPS上调PC-3细胞炎性因子TNF-?、IL-1?、IL-1?、COX-2和IL-6,趋化因子IL-8和MCP-1及粘附分子ICAM1的表达,而1,25(OH)2D3可抑制LPS上调的IL-6、COX-2、IL-8、MCP-1和ICAM1的表达。实验5结果显示:LPS和1,25(OH)2D3对PC-3细胞AKT信号没有影响;LPS上调PC-3细胞MAPK/p38信号,1,25(OH)2D3对LPS上调的p38信号无抑制作用;但1,25(OH)2D3显著抑制LPS诱导的NF-?B和STAT3信号的激活。结论:1,25(OH)2D3通过下调NF-?B和STAT3信号激活,抑制炎症介导的PC-3细胞增殖、迁移和侵袭能力。综合以上三个研究的结果,本课题得出如下结论:(1)生命早期维生素D持续缺乏通过激活前列腺NF-?B和STAT3信号,加剧局部炎症促进中年ICR小鼠前列腺增生;(2)生命早期维生素D持续缺乏促进中年TRAMP小鼠前列腺癌生长和转移,肿瘤微环境NF-?B和STAT3信号可能在该过程中发挥重要作用;(3)维生素D可通过部分阻断NF-?B和STAT3信号,抑制炎症诱导的前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。