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白藜芦醇(Resveratrol,Resv)是一种天然的抗氧化剂,可用于治疗多种疾病。然而对其抗氧化机制的研究仍停留在直接清除自由基抑或与抗氧化酶相互作用的水平。在前期研究中我们发现Resv的抗氧化作用与自噬有关,据此,本文将进一步深入探讨Resv诱导线粒体自噬的作用与机制。首先我们以拘束应激建立氧化应激小鼠模型,雄性昆明小鼠随机分为正常对照组、拘束应激组、Resv低剂量组(i.g.7.5mg/kg)组、Resv中剂量组(i.g.15mg/kg),Resv高剂量(i.g.30mg/kg)组、雷帕霉素组(Rapa, i.p.1mg/kg)和维生素C组(VitC, i.g.15mg/kg),每组6只。小鼠拘束18h、恢复12h后测定相关指标,评价Resv对拘束负荷小鼠腹腔巨噬细胞氧化损伤的影响。结果显示,Resv与抗氧化剂VitC均能修复拘束导致的小鼠腹腔巨噬细胞的氧化损伤,如线粒体膜电位的下降、细胞凋亡以及吞噬功能的下降,且自噬促进剂Rapa也能明显减轻上述氧化损伤。同时,拘束应激代偿性地诱导自噬小体增加而Resv则进一步增强自噬的发生。其次,我们以AAPH(5mM,24h)处理RAW264.7巨噬细胞建立氧化应激细胞模型,探讨Resv修复巨噬细胞氧化损伤的作用机理。我们依次进行了以下实验:(1)采用MTT法测定巨噬细胞增值抑制率、荧光显微术观察细胞凋亡以及流式细胞术检测巨噬细胞吞噬荧光微球的能力。结果显示,AAPH对RAW264.7巨噬细胞的增殖抑制作用具有时间和剂量依赖关系,形态学结果显示AAPH处理后细胞出现了典型的凋亡小体,而Resv能缓解AAPH对细胞增殖的抑制作用。同时,Resv还能提高AAPH处理后RAW264.7的吞噬功能。(2)采用荧光酶标仪检测RAW264.7巨噬细胞内ROS水平、流式细胞术检测线粒体膜电位以及RT-PCR术检测编码线粒体呼吸链复合物I亚基的NDUFS8基因的表达。结果显示,Resv能够减少AAPH诱导的RAW264.7巨噬细胞内ROS的产生。同时,Resv还能提高AAPH处理后RAW264.7细胞内线粒体膜电位和NDUFS8基因的表达水平。Rapa和Resv有协同作用,都有利于线粒体功能的恢复,而3-MA则抑制了Resv的作用,导致线粒体功能的进一步下降。(3)采用流式细胞术、透射电镜技术和Westernblotting等技术检测细胞内的线粒体自噬水平。MDC染色的结果初步表明Resv能明显提高AAPH处理后RAW264.7细胞内的自噬水平;Western blotting实验结果显示,Resv能显著上调Beclin1的蛋白表达水平,并促进LC3I向LC3II的转化;电镜结果显示,正常组的线粒体呈现健康的管状,而在AAPH处理的细胞中则观察到肿胀的线粒体,且伴有自噬体的形成。Resv能改善AAPH处理的RAW264.7细胞内线粒体的形态,并且进一步提高线粒体自噬的水平。(4)采用Westernblotting、激光共聚焦显微术和siRNA对SIRT3的基因干扰技术考察Resv通过自噬保护巨噬细胞的信号转导途径。结果显示,用siRNA干扰SIRT3基因表达后,AMPK的活化、Beclin1的表达及LC3II/I的转化比例均降低。激光共聚焦显微结果显示Resv诱导线粒体自噬的发生,而经siRNA干扰SIRT3后,细胞自噬水平明显下降。此外, siRNA SIRT3能够降低Resv提高的AAPH处理的RAW264.7细胞的吞噬功能,但该组细胞吞噬率仍然高于AAPH组,提示Resv部分通过SIRT3/AMPK/自噬信号通路来发挥修复氧化损伤的作用。综上所述,拘束应激或AAPH诱导产生的ROS会导致巨噬细胞吞噬功能的下降和线粒体功能的损伤。线粒体氧化损伤诱导SIRT3代偿性上调,激活AMPK通路诱导线粒体自噬的发生,但是代偿性的自噬不足于修复氧化损伤。Resv通过激活SIRT3/AMPK信号转导途径进一步增强线粒体自噬的发生,从而修复巨噬细胞的氧化损伤。但是,Resv只是部分通过SIRT3/AMPK/自噬正反馈信号通路来发挥修复氧化损伤的作用。本研究结果深入地阐述了Resv通过上调线粒体自噬缓解氧化应激的分子机制,同时也为研究抗氧化机制和线粒体自噬信号通路提供了一个新的方向,有助于推动线粒体质量控制在疾病发生中的作用的研究。