研究目的:本研究对43例Alport综合征(Alport Syndrome,AS)患者的临床资料进行分析,初步探讨AS临床特点;利用目标序列捕获联合高通量测序技术对患者进行基因检测,丰富AS基因突变谱;结合患者临床特点、病理检查和基因检测结果,完善AS个体化诊断;明确AS基因突变类型,分析AS基因型和临床表型之间的关系;利用体外Mini基因实验对3个COL4A5基因突变进行功能性分析,促进对AS发病机制的理解。研究方法:1.选取2015年1月至2018年12月在东部战区总医院儿科或肾脏科就诊的43例临床确诊或疑诊为AS患者,通过基因检测后所有患者均明确AS诊断。对患者的临床资料进行分析,包括性别、发病年龄、首发症状、发现首发症状原因、有无血尿蛋白尿、有无眼耳异常、有无肾炎或终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)家族史、肾功能情况、肾脏及皮肤组织病理学检查结果等,初步探讨AS患者临床特征。使用SPSS软件进行统计学分析,计量资料使用均数±标准差(？)表示,采用t检验分析;计数资料使用例数和百分比表示;不同性别AS患者进展至ESRD的时间比较采用Kaplan-Meier法分析。以α=0.05为检验水准,P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01认为差异显著。2.经东部战区总医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书后,收集43例确诊或疑诊为AS的患者及部分家系成员外周血标本,利用目标序列捕获联合高通量测序技术对所有先证者进行基因检测,并进行家系验证。结合患者临床表型、病理检查结果,完善AS个体化诊断。将X连锁显性Alport综合征(XLAS)家系按基因型分为2组:无义突变、移码突变及经典剪接位点突变为1组,错义突变为2组,比较两组基因型与临床表型之间的关系。3.通过生物信息学软件预测可能影响pre-mRNA剪接过程的突变,利用体外Mini基因实验对1个COL4A5基因错义突变(c.2767G>T,p.G923C)和2个发生在同一位点的剪接突变(c.2917+1 G>C和c.2917+1 G>A)进行功能性研究,分析不同突变对pre-mRNA剪接过程产生的影响。研究结果:1.43名AS患者,男女比例为1:1.39。患者发病年龄从3个月到22岁不等,男女发病年龄无统计学差异(P>0.05)。AS发病年龄较早,其中39.5%患者在3岁前即出现症状,大部分(81.4%)患者在10岁前发病。AS患者首发症状表现多样,以肉眼血尿、镜下血尿及蛋白尿为主(76.7%),此外还可有尿频尿急、泡沫尿、浮肿、皮疹、听力下降等表现;大部分患者(60.5%)发病时无自觉症状,常因呼吸道感染或其他类型疾病就诊偶然发现尿检异常。家系调查发现27名家系成员进展至ESRD,其中男性16名,进展至ESRD平均年龄为29.2±1.6岁;女性11名,进展至ESRD平均年龄为57.2±2.4岁,不同性别患者进展至ESRD年龄有显著差异(P<0.01)。血尿为AS最常见的临床表现,肾外表现少见。肾组织电镜检查、肾组织Ⅳ型胶原α链染色及皮肤组织Ⅳ型胶原α链染色的诊断率分别为77.8%、72.2%和62.5%。2.经基因检测后,43名先证者均明确AS诊断,包括XLAS 36例(83.7%);ARAS5例(11.6%);ADAS 2例(4.7%)。共发现48个COL4A3、COL4A4、COL4A5和COL4A6基因突变,经HMGD、LOVD和Clinver数据库以及文献检索,29个基因突变为新发现的突变。家系验证结果:36例XLAS先证者,24位遗传自母亲,4位遗传自父亲,6位为新生突变,2位来源未知;5例ARAS先证者检出突变均为复合杂合突变,即两个突变一个遗传自父亲,一个遗传自母亲;2例ADAS先证者1例遗传自母亲,1例来源未知。将XLAS家系按基因型分为2组:无义突变、移码突变及经典剪接位点突变为1组,错义突变为2组。两组之间的发病年龄无统计学差异(P>0.05),1组平均蛋白尿水平为1.16±0.89 g/24h,2组平均蛋白尿水平为0.58±0.54,差异有统计学意义(P<0.05)。1组男性患者发展至ESRD平均年龄为22.89±3.02岁;2组男性患者发展至ESRD平均年龄为28.20±5.59岁,差异有统计学意义(P<0.05)。3.36个COL4A5基因突变经生物信息学软件预测,共11个突变可能影响pre-mRNA剪接过程,包括4个经典剪接位点突变(c.2918-1G>C、c.2917+1G>C、c.2917+1G>A、c.834+2T>G)、3个非经典剪接位点突变(c.780+5G>A、c.2395+3A>G、c.1032+5delG)、3个错义突变(c.4706G>T、c.2767G>T、c.2509G>T)和1个无义突变(c.4705C>T)。体外Mini基因实验证实c.2767G>T突变实际为剪接突变,导致COL4A5基因32外显子完全缺失;c.2917+1 G>A、c.2917+1 G>C剪接突变均产生三种转录产物:1)33外显子部分缺失(96bp);2)33外显子完全缺失;3)33、34外显子均完全缺失,但两种突变主要剪接效应不同:c.2917+1 G>A突变以33外显子部分缺失为主,c.2917+1 G>C突变以33外显子完全缺失为主。结论:1.Alport综合征患者发病年龄较小,起病隐匿,临床表现多样,以肉眼血尿、镜下血尿和蛋白尿为主,临床易出现漏诊或误诊。男性患者进展至ESRD较女性患者早。截断突变和剪接突变患者临床表型较错义突变患者更为严重。2.目标序列捕获联合高通量测序技术是一种高效、快速的基因检测方法,基因检测丰富了AS突变谱,完善了AS的个体化诊断,有助于AS患者预后判断。3.Mini基因实验是一种简单有效的剪接突变分析方法,对突变同时进行DNA和RNA水平的分析,有助于理解疾病的分子发病机制。实验证实COL4A5基因c.2767G>T突变实际为剪接突变,位于同一位点碱基改变不同的两个突变c.2917+1 G>A、c.2917+1G>C产生的转录产物类型相同但主要剪接效应不同。