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油茶(Camellia oleifera)是我国重要的木本油料树种,与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料树种。超长链脂肪酸为生物体中碳原子数超过18碳的脂肪酸。这类脂肪酸在生物体中具有广泛的生理功能,它们参与种子甘油酯、生物膜膜脂及鞘脂的合成,并为角质层蜡质的生物合成提供前体物质。角质层是植物自我防护的最后一道屏障,在植物生长发育、适应外界环境作用方面中起重要作用。β-酮脂酰-CoA合酶是在内质网中催化超长链脂肪酸合成的第一步缩合反应的限速酶,β-酮脂酰-CoA合酶基因(KCS)的克隆对定向调控油料作物的油脂成分、提供有益脂肪酸具有重要的作用。本论文主要研究结果如下:
1.油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的鉴定。在本实验室已构建的油茶cDNA文库中发现一条β-酮脂酰-CoA合酶基因,经过测序拼接其长度为1147bp,并且含有一个polyA尾巴。将此cDNA序列经过在线翻译并同其它物种的同类蛋白质序列进行比对发现,此cDNA克隆从其第51bp的位置至779bp处属于编码区,除去前51个碱基载体序列,发现此cDNA与其它物种的同种蛋白质的相比5’端缺失了约290个氨基酸残基及非编码区的cDNA序列,3’端是完整的。
2.油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的全长cDNA克隆。根据已知的油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的 EST序列,用专业软件Primer Premier5.0设计了油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的特异引物GSP1、GSP2及GSP,采用5RACE技术,以油茶‘湘林1号’种子为材料提取RNA,并扩增出一条约1300bp的cDNA片段。将该片段连接、转化到大肠杆菌DH5α菌株中,经过测序得到该片段的cDNA序列。通过Vector NTI9.0等生物软件的分析,将该序列与原来的 EST序列进行拼接,获得了一条长为1575bp的序列。根据拼接得到的序列,设计了一对引物F1和R1,其中F1位于油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的5’端起始密码子处,R2位于3端终止密码子处,用RT-PCR产物作为模板,经扩增得到的片段大小与理论上大小一致,并将拼接后的片段回收、克隆、转化及测序。由此得到的测序结果与拼接的全长cDNA序列完全一致,从而获得了油茶油条β-酮脂酰-CoA合酶基因的全长cDNA序列。
3.油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的功能预测。通过生物信息学软件Vector NTI9.0对测序结果进行分析发现,此cDNA长1891bp,含有一个长1575bp的ORF,起始密码子为ATG,终止密码子为 TAG,编码525个氨基酸残基,还包括5’非编码区45bp和3’非编码区268bp及一个长50bp的polyA尾巴。经过在GenBank上的序列比对获知此序列与其它物种的油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的相似性达到85％,由此确认此序列是油茶的β-酮脂酰-CoA合酶基因的全长cDNA序列。根据此cDNA序列推导的蛋白质序列,应用生物信息学软件 Antheprot5.0对其二级结构、等电点、分子量、跨膜结构、信号肽等进行功能预测分析,结果显示此蛋白的等电点pI为9.475,分子量为58173.716Da,共有四个跨膜结构域,其中59～73,97～110两个位置与其它物种的油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因跨膜结构相吻合,254～261,387～389存在跨膜结构的可能性较小。应用 Vector NTI9.0软件将油茶的油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因与其它物种的同类蛋白质进行亲缘关系的分析,不同物种在遗传进化上主要有两个分支。其中,白菜型冬油菜、芥菜、甘蓝、甘蓝型油菜、海甘蓝等属于一类,而油茶、大麦、小麦、马铃薯、棉花、拟南芥等属于另一类。