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免疫治疗是肿瘤的辅助治疗方法之一，有效的免疫应答依赖于两大免疫系统的活化，即细胞免疫和体液免疫，尤其是CD8+T细胞，它能抑制肿瘤生长，清除肿瘤细胞，而CD4+T细胞有助于抗肿瘤免疫应答的激发和维持。 肿瘤特异性免疫治疗的关键是发现并鉴定肿瘤特异性抗原。自Boon首次成功分离出3种人类肿瘤特异性抗原以来，一系列的肿瘤特异性抗原相继被发现并得到确认。MAGE-3(又名MAGE-A3)为肿瘤特异性抗原，属于MAGE家族，它不仅表达于大部分的黑色素瘤，而且广泛表达于人体的多种肿瘤细胞中，比如肝细胞肝癌、头颈部鳞癌、睾丸精原细胞瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌等等。除睾丸和胎盘外，MAGE-3基因在正常的组织中均不表达。故MAGE-3被公认为是肿瘤特异性免疫治疗的理想靶点。 肿瘤疫苗是利用肿瘤抗原诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，以调节机体免疫功能，达到治疗肿瘤的目的。肿瘤疫苗包括抗原肽疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗等等。蛋白疫苗的特点是含有已知和未知的CD8+T细胞表位和CD4+T细胞表位，其抗肿瘤作用不被特定的HLA表型所限制，既可通过MHC-Ⅰ类分子途径，又可通过MHC-Ⅱ类分子途径来激活抗肿瘤免疫应答，故采用蛋白疫苗可能更有临床应用意义。 本研究通过RT-PCR从人体胎盘中扩增MAGE-3全长编码序列，并将其克隆至pGEX-4T-2原核表达载体中，转化大肠杆菌BL-21，经IPTG诱导表达，表达产物经Glutathione Sepharose 4B纯化后获得GST-MAGE-3蛋白。同时将MAGE-3 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3.1+中，通过脂质体介导转染鼠黑色素瘤B16细胞，构建了能表达人MAGE-3的B16株。在体外，GST-MAGE-3蛋白冲击胃癌患者的外周血单个核细胞(PBMCs)能诱导特异性CTL杀伤活性。在小鼠体内，经GST-MAGE-3蛋白冲击的脾细胞既能诱导出特异性的CTL杀伤活性，活化CD4+T细胞，也能激活体液免疫应答。 ’ 浙江大学博士学位论文第一部分GST－MAGE《原核表达载体的构建及其表达目的：构建重组表达质粒PGEX－4T－2／MAGE－3，并在大肠杆菌中表达及纯化GST－MAGE－3蛋白。方法：通过RT－PCR扩增eGE－3全长编码序列，将该片段克隆至PGEX－4T－2原核表达载体，转化大肠杆菌BL－21，经IPTG诱导表达，并经 10％SDS－PAGE凝胶电泳、考马斯亮蓝染色及Westen blot鉴定。用Glutathione Sepharose 4B纯化表达产物。结果：正确构建了重组原核表达质粒PGEX－4T－2／MAGE－3，测序结果正确，并在大肠杆菌中高效表达了融合蛋白GST－MAGE－3。结论：成功获得了GST－MAGE－3融合蛋白。第二部分 GST－MAGE－3蛋白冲击胃癌病人外周血单个核细胞（PBMCS） 诱导特异性抗肿瘤免疫应答目的：体外观察GST－MAGE－3蛋白刺激胃癌患者外周血单个核细胞（PBMCS），诱导特异性抗肿瘤免疫应答。方法：获取胃癌患者外周血单个核细胞，在体外经GST－MAGE－3蛋白冲击后作为抗原提呈细胞，与自身淋巴细胞共培养，收集淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验和CTL杀伤试验。结果：经GST－MAGE－3蛋白冲击的PBMCS能增强淋巴细胞的增殖能力，与对照组相比，有显著性差异。在效靶比为25：l和12．5：1时，与GST4IAGE－3蛋白冲击后的PBMCS共培养的淋巴细胞，在体外对MAGE－3阳性的SGC－7901细胞的杀伤效应与对MAGE－3阴性的MKN－45的杀伤效应相比，有显著性差异，而GST组和 Elution buffer组的淋巴细胞对 SGC－7901和 MKN－45两组靶细胞均无特异性杀伤效应。结论：经GST－MAGE－3蛋白抗原冲击的外周血单个核细胞，在体外能有效提呈抗原，激活抗原特异性CTL，诱导特异性抗肿瘤免疫应答。第三部分 人MAGB七真核表达载体的构建与表达目的：克隆人黑色素瘤特异性抗原MGE－3基因，构建真核表达载体，建立人MAGE－3阳性的小鼠B16细胞株，并制备肿瘤核酸疫苗。方法：用RT－PCR方法扩增MAGE－3。DNA，以pcDNA3．卫＋为载体，构建重组表达质粒pcDNA3．1＋／MAGE－3。重组质粒用脂质体介导转染鼠黑色素瘤B16细胞，经RT－PCR、免疫细胞化学染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中sGE－3的表达。结果：正确构建了pCDNA3．l＋／MAGE－3重组质粒，并且在转化细胞中检测到了MAGE－3的表达。结论：成功构建了pcDNA3．1＋／MAGE－3真核表达质粒，建立了表达人MAGE－3的鼠黑色素瘤＊ 细胞株。 2 浙江大学博土学位论文第四部分GST－－MAGE｛蛋白冲击小鼠脾细胞诱导特异性抗肿瘤免疫应答目的：体内观察经GST4lA（i－3蛋白刺激的小鼠脾细胞诱导特异性抗肿瘤免疫应答的能力。方法：以经 GST－MAGE－3蛋白冲击的小鼠脾细胞为抗原递呈细胞（APC），兔疫己接种 hE－3阳性B16细胞的C57BL／6小鼠，免疫3次后取小鼠脾淋巴细胞、血清、肿瘤组织，分别检测脾淋巴细胞CTL杀伤活性、细胞因子IL－2和IFN－Y浓度、MAGE－3抗体滴度及抑瘤率。结果：用GST－MAGE－3蛋白冲击的小鼠脾细胞免疫已接种