【摘 要】
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烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide,NMN）是一种天然存在的核苷酸,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的重要前体物质。目前NMN的主要合成方式包括化学法合成和生物发酵法、酶法合成。而在三种主要的合成方式中,酶法合成不产生手性化合物、环保高效,因而成为较优的合成方式。但相对昂贵的底物、高成本的酶制剂限制了酶法合成的推广应用。本研究旨在利用大肠杆菌分泌表达NMN合成途
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烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide,NMN）是一种天然存在的核苷酸,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的重要前体物质。目前NMN的主要合成方式包括化学法合成和生物发酵法、酶法合成。而在三种主要的合成方式中,酶法合成不产生手性化合物、环保高效,因而成为较优的合成方式。但相对昂贵的底物、高成本的酶制剂限制了酶法合成的推广应用。本研究旨在利用大肠杆菌分泌表达NMN合成途径酶,并优化反应条件进行NMN的催化合成。具体研究结果如下:（1）分别成功构建以下三酶的大肠杆菌分泌表达菌株:Sulfurovum sp.FS06-10来源的烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt,EC2.4.2.12,简称Sfnampt）、Thermococcus kodakarensis KOD1来源的磷酸核糖焦磷酸激酶（Phosphoribosyl phosphate synthase,Prs,EC 2.7.6.1,简称Tkprs）及Escherichia coli K12来源的核糖激酶（Ribokinase,Rbks,EC 2.7.1.15,简称Erbks）。将信号肽Pel B与三酶分别融合表达,通过信号肽引导三酶分泌至胞外,在发酵上清液中可检测到Sfnampt、Tkprs、Erbks的酶活性分别约为1.1±0.1 U/L、21.1±2.8 U/L、29.5±2.7U/L。（2）对三种分泌表达的酶进行酶学性质分析。在最适反应条件方面,Sfnampt的最适温度为45℃,最适p H为7.5;Tkprs的最适温度为50℃,最适p H为8.5;Erbks的最适温度为37℃,最适p H为5.5,且在p H 5.0～8.5范围内可以维持80%以上的酶活性。在热稳定性方面,Sfnampt的热稳定性较差,在35℃下处理3 h后,残余酶活性约为80%,而在40～55℃处理3 h后,其残余酶活性不足60%;Tkprs的热稳定性良好,在40～60℃处理3 h后,残余酶活性高于90%;Erbks的热稳定性良好,在25～40℃处理3 h后,残余酶活性高于90%。对三酶进行酶动力学分析。以NAM为底物,Sfnampt的Vmax为0.65±0.07μmol/（L*min）,Km为2.87±1.10μmol/L;以核糖-5-磷酸为底物,Tkprs的Vmax为2.37±0.10μmol/（L*min）,Km为25.48±5.22μmol/L;以核糖为底物,Erbks的Vmax为12.58±1.44μmol/（L*min）,Km为74.13±22.15μmol/L。与已表征的Nampt相比,本研究分泌表达的Nampt底物亲和力较差,可能会成为NMN合成的限制因素。Tkprs、Erbks与已表征的Prs、Rbks相比,其底物亲和力好,适合用于NMN的催化合成。（3）将三种分泌表达菌株的发酵上清液作为分泌的粗酶,投入催化体系进行NMN的合成,并对催化体系进行优化。初步优化结果表明,最适反应条件为温度37℃、pH 8.0;在三个底物中,ATP为体系中的关键因素,提高其在三个底物中的比例对NMN的合成有较大的促进作用。三酶中Sfnampt是催化NMN生成的限制因素,提升其在体系中的比例对NMN的合成有较大的促进作用。优化后的催化体系在7 h的催化反应后可生成5.5μmol/L的NMN,以核糖为底物的转化率为5.5%,相比原始体系转化率提高71倍。
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