论文部分内容阅读
TRAIL为Ⅱ型跨膜蛋白，属于TNF家族分子。它可诱导某些敏感细胞的凋亡，包括肿瘤细胞与转化细胞。尽管TRAIL与其它TNF家族分子如TNF-α、FasL等在结构上存在同源性，但功能上却有很大差异，主要表现在它选择性诱导多种肿瘤细胞的凋亡却保护大多数正常细胞免于受损，突破了TNF-α、FasL等分子在体内应用的局限性。 本研究构建人TRAILcDNA的真核表达载体，对TRAIL分子的凋亡效应进行初步研究。 通过高保真聚合酶链式反应(PCR)方法扩增带有人TRAIL114～281aa的基因片段。随即将目的片段连入pGEX-6p-1，经过酶切与测序证实扩增得到的DNA的正确性。重组表达载体pGEX-6p-1-TRAIL在大肠杆菌表达系统中进行IPTG诱导表达，将表达产物免疫小鼠，制备多克隆抗血清。将经过DNA序列测定后的人TRAILcDNA克隆进真核表达载体pcDNA3，真核重组表达载体pcDNA3-TRAIL经脂质体介导转染CHO细胞，间接免疫荧光检测到人TRAIL在CHO细胞中的表达。采用MTT法和Annexin V-FITC法及流式细胞仪技术测定重组TRAIL对7402肝癌细胞的抑制活性。将7402肝癌组织移植于裸鼠皮下，建立裸鼠皮下肿瘤模型，构建了真核表达载体pcDNA3-TRAIL，对建立的皮下肿瘤模型进行治疗。 DNA序列测定结果显示：克隆的人TRAILcDNA与文献报道基本一致。SDS-PAGE电泳结果显示，人TRAILcDNA可以在大肠杆菌表达系统中表达。间接免疫荧光显示转染后的CHO细胞的胞浆内有目的蛋白的表达。MTT和流式细胞仪结果显示重组TRAIL在体外可抑制7402肝癌细胞的生长，凋亡率可达31%，治疗结果显示，克隆的人TRAILeDNA可以在小鼠体内表达，达到抑制7402肝癌细胞在裸鼠体内的生长。本研究成功克隆并表达了人TRAIL，可以用来对裸鼠皮下肿瘤模型进行治疗。