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为建立水牛精原细胞增殖及分化的培养体系,本研究以本地水牛睾丸为材料,进行了如下研究:(1)探讨了水牛曲精细管发育过程中的细胞类型变化规律。结果发现,水牛出生后曲精细管的直径逐渐增大,由初生时的37.5～50.0μm增大到10～12月龄的125.0～150.0μm,生精细胞由初生时的单一性原细胞逐步分化形成精原细胞、精子细胞和精子,其中3～5月龄水牛曲精细管的直径约为75.0～87.5μm,生精细胞主要为精原细胞,是研究精原细胞分离培养的最佳材料。(2)探讨了水牛睾丸支持细胞的分离、纯化培养方法。结果发现,3～5月龄水牛睾丸组织采用胶原酶、胰蛋白酶两步法消化后,平均每克组织得到2.61×10~6个细胞,平均活率为89.37%;用差异黏附法和高温培养法(38.5℃培养24h)纯化后,支持细胞纯度达90%以上;RT-PCR检测及测序发现,支持细胞表达GATA4,GDNF,而精原细胞表达GDNF受体。(3)探讨了水牛精原细胞的分离、纯化及培养方法。结果发现,曲精细管片段培养极容易漂浮,而组合酶消化后再培养,所得精原细胞较多;Percoll纯化后精原细胞纯度可达62.95%;AKP染色显示,支持细胞呈阴性,管周样细胞和未分化的精原细胞呈阳性,分化的精原细胞表达C-Kit;精原细胞培养4wk后出现单倍体精子细胞,经RT-PCR检测证实,获得单倍体精子细胞特有的基因PRM-2。以上结果表明,(1)随着水牛睾丸曲精细管的发育,其细胞组合类型发生明显改变,3～5月龄水牛的睾丸曲精细管主要为精原细胞,可用于分离精原细胞;(2)差异黏附法和高温培养法可用于纯化培养水牛支持细胞;(3)组合酶消化培养法培养精原细胞效果优于曲精细管片段法;(4)AKP染色以及C-Kit检测可以鉴定水牛睾丸体细胞,分化及未分化型的精原细胞;(5)水牛精原细胞可用Percoll进行纯化,经体外培养可分裂、分化形成精子细胞。