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秀丽线虫(Caenorhabditis elegans,C. elegans)是1974年Brenner首次公开报道的模式生物,其优点很多,是进行遗传、基因研究方面的首选模式生物。线虫生长周期短,实验室饲养简便,具备完整的发育和解剖学特征,已完成全基因组测序,基因操作便捷,如转基因、基因突变、RNA干涉等。本研究将线虫应用于Ngb对氧化损伤的作用研究及缺氧状态下细胞骨架的变化分析,旨在促进对低氧应答机制的理解及氧化应激损伤保护的防护基础研究。 1、利用秀丽线虫研究Ngb抗氧化损伤的作用： Ngb是新近发现的氧结合珠蛋白超家族成员,表达于神经系统,具有抗氧化损伤作用。Ngb含有两种重要的氨基酸:组氨酸和半胱氨酸,对Ngb的蛋白质结构及功能具有重要作用。为了探讨Ngb的抗氧化作用及作用机制,使用hNgb转基因线虫来进行百草枯(paraquat,PQ)处理,结果显示Ngb具有抗氧化作用。使用免疫共沉淀分析Ngb的相互作用蛋白,但未见明显结果,有可能Ngb是通过自身的重要结构来发挥抗氧化作用。还构建了Ngb的双突变表达载体,进行显微注射,以期获得Ngb的突变株系,进一步探讨Ngb抗氧化损伤的作用机制。 秀丽线虫体内有33种globin,远多于脊椎动物,其中glb-13是人源Ngb(hNgb)的同源物,氨基酸序列具有20％的相似性,有相同的功能域。为了探讨glb-13的抗氧化作用及其发挥作用的信号通路,我们通过线虫的交配构建了线虫重要通路hif-1与daf-16和glb-13的双突变株系,并进行PQ处理来统计成虫率,结果显示glb-13(tm2825)突变株系不能恢复PQ引起的氧化损伤,hif-1的glb-13双突变株系的抗氧化作用低于glb-13(tm2825),说明hif-1在glb-13抗氧化作用的信号通路上可能发挥重要作用。在mRNA水平上,glb-13表达水平上调,与其抗氧化表型吻合,glb-13具有抗氧化应激作用,而glb-13的抗氧化应激作用不受HIF-1调控,可能与DAF-16和Nrf-2相关。同时,我们构建了以glb-13为启动子的表达载体,通过EGFP的可视化显示glb-13在线虫体内的分布与表达,以期获得其转基因株系,从而从蛋白质水平探讨glb-13的抗氧化作用。从Ngb的同源物角度进行Ngb的抗氧化作用研究,反映了Ngb具有抗氧化的作用,因此研究glb-13的功能对于理解Ngb的功能进化性具有重要意义。 2、利用秀丽线虫研究细胞骨架蛋白在缺氧中的作用机制： 细胞骨架蛋白是支撑细胞的重要结构,不可或缺。细胞骨架蛋白的功能非常广泛且十分重要,参与细胞的基本生命活动,如细胞运动、物质运输和能量转换、细胞分化、信号转导等。其中,细胞骨架在抗缺氧方面的作用同样重要。为了探讨细胞骨架蛋白在缺氧中发挥的作用,选取原肌球蛋白(tropomyosin)突变株系lev-11(x12)研究细胞骨架在缺氧中的作用。结果显示lev-11突变后对缺氧敏感,蛋白水平显示LEV-11上调,说明细胞骨架蛋白能对抗缺氧引起的损伤。