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已经有多种方法用于测定不同生物样品中蛋白质总含量,同样也有很多方法用于间接检测蛋白质酸性残基和碱性残基以获得蛋白质的一些结构信息。然而，迄今为止，还没有用电泳滴定的方法来测定蛋白质含量或者分析蛋白质酸性残基或碱性残基等结构信息。移动反应界面(move reaction boundary,MRB)理论已经在生化分离与分析的多个领域中有着重要的应用，其中就包括首次实现酸碱电泳滴定。MRB理论在酸碱电泳滴定中的应用启发了我们将其应用于蛋白质定量与结构分析中，首次实现蛋白电泳滴定。 本文具体研究内容如下： 1.电泳滴定酸碱的新原理、新装置与新方法 一种电泳滴定酸或碱的新原理、新装置与新方法首次被提出。其主要原理是在电场作用下，在电泳管中建立由HCl和NaOH形成的移动中和界面,用pH指示剂指示界面移动，当NaOH浓度一定时，建立界面移动距离(D)与ln[HCl]的标准曲线。电泳滴定实验结果揭示：(i)ln[HCl]与D存在的良好的线性关系可用于测定未知HCl的浓度;(ii)不同pH指示剂的选择对电泳滴定酸碱结果没有明显影响;(iii)电泳滴定酸碱结果具有较好的精密度,日内相对标准偏差RSD<2.0％;日间RSD<4.0%。 2.基于移动反应界面电泳滴定可视化测定蛋白含量 基于MRB原理，首次提出并建立可视化电泳滴定——移动反应界面滴定法(MRB titration，MRBT)用于蛋白质含量分析。在新方法中，继续使用电泳滴定酸碱中搭建的实验装置，MRB由阴极液中的氢氧根离子和固定在高交联度的聚丙烯酰胺凝胶(PAG)中的蛋白质分子在电场作用下形成。同样用酸碱指示剂来指示MRB的移动。建立界面移动速度与蛋白质浓度的标准曲线，测定未知浓度蛋白与氢氧根离子形成界面的移动速度，代入标准曲线从而计算得到未知蛋白浓度。此外，MRBT方法还呈现如下特点：（1）MRBT法所检测的蛋白质是固定在PAG中的，与其他方法如传统色谱和电泳方法中检测的可移动的蛋白质不同；（2）蛋白质含量检测通过可视化的MRB移动；（3）三聚氰胺等非蛋白氮（NPN）对MRBT法检测蛋白质的影响很小。新建立的MRBT方法可应用于实际样品，如牛奶，豆浆和血清等总蛋白含量的检测。 3. MRBT法测定婴儿奶粉与豆浆中总蛋白含量 建立MRBT法快速准确测定婴儿奶粉与豆浆中总蛋白含量。在此体系中，MRB由氢氧根离子和固定在高交联度的PAG中的牛奶蛋白或豆浆蛋白分子在电场作用下形成，同样用酸碱指示剂来在线实时指示MRB的位置。我们选取了五种市售的婴儿奶粉(Enfakid，Beingmate,Yili,Nestle和Scient)和四种市售大豆(Bao Li Lai，You Ji Nong Zhuang,He Yu和Sheng Long)来验证方法的可行性。基于MRB移动速度与牛奶蛋白或豆浆蛋白浓度之间的函数关系建立标准曲线。由于MRB是由氢氧根离子和固定的蛋白质的酸性残基形成，而不是和碱性残基或添加进的NPN形成，所以NPN对MRBT方法的影响很小。此外，MRBT法测定的奶粉或豆浆中蛋白总含量结果与凯氏定氮法（kjeldahl）相比差别不大，但是比kjeldahl法检测速度更快，重复性更好。 4.移动反应界面滴定(MRBT)分析蛋白质分子的游离酸性残基和碱性残基数目 在一个微型的芯片电泳装置上，通过MRBT电泳滴定测定蛋白质分子的游离酸性残基和碱性残基数目。根据MRBT理论，揭示蛋白质分子的游离酸性残基和碱性残基数目与其MRB的移动存在函数关系。我们选取了七种标准蛋白质作为研究对象。实验结果表明通过MRBT测定的蛋白质分子的游离酸性残基和碱性残基数目与NCBI数据库中蛋白质的氨基酸序列计算出来的数目具有良好的一致性，证明了此方法可以有效快速的测定蛋白质分子的游离酸性残基和碱性残基数目。