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肿瘤是威胁人类健康的世界性课题。目前恶性肿瘤的治疗,仍然是以手术为主并辅以放、化疗,尽管如此,仍有相当一部分病人最终死于肿瘤的复发和转移。干细胞是指能够分化成为多种成熟细胞的特殊细胞,是胚胎发育、器官形成的基础。肿瘤干细胞理论认为,肿瘤发生源于基因突变的多能干细胞,这类细胞具有永久自我更新和分化能力,正是由于这类细胞的存在,肿瘤才能不断生长。目前放疗和化疗主要针对肿瘤中已分化的细胞亚群,并不针对肿瘤干细胞,但正是这类所占比例很低的肿瘤干细胞决定了恶性肿瘤的生物学特性。迄今为止,研究者在多种肿瘤组织中分离出具有干细胞特性的肿瘤细胞,这类细胞能够在免疫抑制动物中复制出与原发肿瘤生物学特性一样的肿瘤组织。普通肿瘤免疫治疗应用的抗原大多是表达在已分化肿瘤细胞上,但肿瘤干细胞本身并不一定表达这类抗原,因此加载普通抗原的树突细胞疫苗对肿瘤干细胞没有很好的靶向性。利用特异性肿瘤干细胞抗原研制新型树突细胞疫苗,将有望弥补现在肿瘤治疗方法的不足。目前分离肿瘤干细胞主要依靠其特异性分子标记物,乙醛脱氢酶(ALDH)作为肿瘤干细胞特异性标记物已有比较深入的研究[1]。本研究中,我们利用ALDH作为流式细胞仪分选细胞的标记物,从Hepal-6肝癌细胞株和B16黑色素瘤细胞株中分选出ALDH+细胞作为肿瘤干细胞,并验证其具有肿瘤干细胞特性,然后制备荷载肿瘤干细胞抗原的树突细胞疫苗,利用小鼠肝癌原位模型和肺转移模型,通过流式细胞仪和小动物活体成像技术研究上述疫苗对小鼠肿瘤免疫功能的影响,以及其中可能的免疫机制,为以后进一步的基础研究及临床应用做铺垫。第一部分制备肿瘤干细胞抗原目的：从Hepal-6肝癌细胞株和B16黑色素瘤细胞株中分选出ALDH+细胞,验证其具有肿瘤干细胞特性,以此制备肿瘤干细胞抗原。方法：使用流式细胞仪,利用ALDEFLUOR干细胞鉴定试剂盒,从Hepal-6肝癌细胞株和B16黑色素瘤细胞株中分选出相应的ALDH+细胞和ALDH细胞；通过肿瘤细胞克隆球形成实验和皮下成瘤实验,验证分选出的ALDH+细胞具有肿瘤干细胞特性；接着使用反复冻融法,分别制备肿瘤干细胞抗原,以及ALDH-细胞和普通肿瘤细胞抗原。结果：Hepal一6细胞和B16细胞流式细胞分选图显示：Hepal-6ALDH所占比例为3.27%,ALDH所占比例为4.09%；B16ALDH’所占比例为3.40%,ALDH所占比例为15.11%。在无血清的培养基中培养10d后,高倍镜视野下(400倍)观察克隆球形成情况：ALDH’细胞形成众多细胞克隆球,而未经分选的普通肿瘤细胞和ALDH细胞则几乎没有细胞克隆球形成,Hepal-6细胞株与B16细胞株所得结果一致。以不同数量肿瘤细胞接种小鼠皮下瘤实验：接种50000、2000、500个Hepal-6ALDH细胞4周后均明显成瘤,而接种未经分选的普通肿瘤细胞和Hepal-6ALDH细胞4周后均没有成瘤,B16细胞系实验结果与Heoal-6细胞系的一致。结论：获得并证明Hepal-6ALDH’细胞和B16ALDH细胞具有肿瘤干细胞特性,经反复冻融后,获得相应肿瘤干细胞抗原。第二部分体外荷载肿瘤干细胞抗原的树突细胞对免疫细胞功能的影响目的：研究体外荷载肿瘤干细胞抗原的树突细胞对免疫细胞功能的影响。方法：体外加载抗原分为四组：A.PBS对照组；B.加载未经分选的普通肿瘤细胞裂解物抗原组；C.加载ALDH肿瘤细胞裂解物抗原组；D.加载ALDH肿瘤细胞裂解物抗原组；与小鼠DC细胞体外共培养,测上清中的IL-12含量；然后将荷载不同抗原的DC与脾细胞(主要以T细胞为主)体外共培养,进行细胞毒实验,靶细胞分别为普通肿瘤细胞和ALDH’肿瘤细胞(肿瘤干细胞)。结果：Hepal-6细胞实验中A.PBS对照组；B.加载未经分选的Hepal-6普通肿瘤细胞裂解物抗原组；C.加载Hepal-6ALDH肿瘤细胞裂解物抗原组；D.加载Hepal-6ALDH肿瘤细胞裂解物抗原组,所得IL-12p70含量分别为54.45±3.976pg/ml,84.82±5.320pg/ml,83.38±5.889pg/ml,83.68±4.507pg/ml,B. C.D三组与PBS对照组有统计学差异(P<0.05),但B、C、D三组之间无统计学差异；B16细胞实验中四组IL-12p70含量分别为54.53±3.705pg/ml,84.12±5.156pg/ml,80.47±4.328pg/ml,85.43±5.260pg/ml,结果提示：B、C、D三组与PBS对照组有统计学差异(P<0.05),但B、C、D三组之间无统计学差异。细胞毒实验中仍然分为四组：A.PBS对照组；B.加载未经分选的普通肿瘤细胞抗原组；C.加载ALDH肿瘤细胞抗原组；D.加载ALDH肿瘤细胞抗原组。当靶细胞为未分选的普通Hepal一6细胞和B16细胞时,E：T值达到20：1,40：1,B组杀伤率优于另外三组(P<0.05),C、D两组之间杀伤率无统计学差别,但优于阴性对照组(P<0.05)(靶细胞为未经分选的普通Hepa1-6细胞和B16细胞的实验结论一致)；当靶细胞为Hepal-6ALDH+细胞和B16ALDH+细胞时,E：T值达到10：1,20：1,40：1,D组杀伤率明显优于另外三组(P<0.05)；B组杀伤率优于A组和C组(P<0.05),A、C两组之间无统计学差别(靶细胞为Hepal-6ALDH+细胞和B16ALDH+细胞的实验结论一致)。结论：不论以何种肿瘤细胞裂解物作为抗原,均可以使DC分泌更多的IL-12；不同肿瘤抗原,均增强免疫细胞对普通肿瘤细胞的细胞毒作用；肿瘤干细胞抗原对肿瘤干细胞有很好的靶向作用。第三部分用于活体成像的小鼠Hepal-6肝原位肿瘤模型和B16肺转移肿瘤模型的建立目的：建立动物模型,为体内实验做铺垫方法：利用质粒转染法,建立用于活体成像的Hepal-6luc细胞和B16luc细胞,体外观测两株细胞荧光表达情况；利用小鼠皮下瘤组织块,建立Hepal-6luc肝原位肿瘤模型；利用小鼠尾静脉注射,建立B16luc肺转移模型；两种肿瘤模型均使用小动物活体成像技术,观测肿瘤荧光表达情况,并进行进一步解剖离体观察,验证动物模型建立成功。结果：体外荧光实验中,细胞数达到104个时就会观察到荧光。Hepal-6luc肝原位肿瘤模型和B161uc肺转移模型活体成像情况良好,解剖后也证实动物模型准确可靠。结论：建立可用于活体成像的小鼠Hepal-6肝原位肿瘤模型和B16肺转移模型,为体内实验提供技术支持。