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目的:急性B淋巴细胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)是一种起源于B淋巴细胞系前体细胞的克隆性血液系统恶性肿瘤。目前,B-ALL患者在接受标准治疗后完全缓解率可达80%以上,但治疗后期出现的疾病进展仍然是B-ALL患者治疗面临的重大挑战。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是一个由基质细胞、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)及可溶性的细胞因子、生长因子等共同组成的动态网络,能够为肿瘤细胞的发生、发展提供营养和支持环境。研究发现,骨髓微环境的动态演变是介导B-ALL进展的关键因素。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAF)是TME中重要的基质细胞,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)为CAF的重要来源。研究显示,CAF可介导骨髓微环境改变促进肿瘤细胞的生长、增殖和浸润,但其在B-ALL中扮演的角色尚不清楚。本文将探讨CAF在B-ALL病程进展中扮演的角色及其与白血病细胞相互作用的潜在分子机制。方法:1.临床样本检测中,本研究分别收集健康对照(n=17)、B-ALL-初诊患者(n=8)、B-ALL-完全缓解患者(n=23)和B-ALL-复发患者(n=7)的骨髓单个核细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测CAF标志物α-SMA和FAP在各组中的表达水平。2.对于BM-MSCs的获取,分别收集B-ALL患者和健康对照来源的骨髓血,应用Ficoll梯度离心法分离培养BM-MSCs,随后对BM-MSCs进行细胞表型、成脂及成骨分化功能的鉴定,并应用P2-P4代BM-MSCs进行实验。3.体外试验中,分别应用RT-PCR、Western blot方法对比健康对照来源和B-ALL来源的BM-MSCs中CAF标志物α-SMA和FAP的表达水平,应用BM-MSCs与ALL细胞株(Nalm-6/RS4;11细胞株)共培养,检测α-SMA和FAP的表达变化,并应用RT-PCR和ELISA方法检测上述共培养体系中CAF相关分泌因子的表达水平。4.在白血病细胞株单独培养或与获得CAF表型的MSCs共培养条件下,应用化疗药物柔红霉素(DNR)进行处理,24小时后收集白血病细胞,分别应用台盼蓝染色及细胞凋亡检测试剂盒分析B-ALL细胞的细胞活性和细胞凋亡改变。进一步探讨CAF在B-ALL微环境中活化的可能机制。5.分别建立Nalm-6细胞单独注射组、Nalm-6+MSCs联合注射组和Nalm-6+获得CAF表型的MSCs联合注射组的小鼠皮下瘤模型,观察各组小鼠瘤组织体积和重量的变化,分析MSCs和获得CAF表型的MSCs对白血病细胞生长和增殖的影响;6.通过体外transwell小室实验、三维细胞培养模型以及慢病毒转染等实验手段探索获得CAF表型的MSCs与白血病细胞之间相互作用促进B-ALL进展的潜在分子机制。结果:1.CAF标志物α-SMA和FAP在B-ALL复发患者中的表达水平明显高于B-ALL完全缓解组和健康对照组(P<0.05);2.体外细胞实验中,正常对照骨髓来源的BM-MSCs与B-ALL来源的BM-MSCs相比,CAF标志物α-SMA和FAP的m RNA、蛋白水平表达无显著差异(P>0.05)。但应用BM-MSCs分别与Nalm-6和RS4;11细胞株共培养48小时后,BM-MSCs中α-SMA和FAP的m RNA、蛋白表达水平增加(P<0.05),同时共培养体系中CAF相关分泌因子Fn、SDF-1、IL-6和TGF-β的表达水平升高;3.与单独培养的Nalm-6/RS4;11细胞株相比,获得CAF表型的MSCs与Nalm-6/RS4;11细胞株的共培养体系能够使白血病细胞在接受DNR处理时其细胞凋亡率明显降低(P<0.05),细胞活性增加(P<0.05);4.向白血病细胞与MSCs的共培养体系中加入TGF-β抑制剂LY2109761能够使α-SMA和FAP的表达下降(P<0.05);在药物处理实验中,与LY2109761和DNR单独处理组相比,联合用药(DNR+LY2109761)组的白血病细胞凋亡率显著增加(P<0.05);5.应用重组人转化生长因子β(rh TGF-β)刺激BM-MSCs能够使MSCs中α-SMA和FAP的表达水平增高(P<0.05);6.将获得CAF表型的MSCs与未处理的MSCs进行对比,通过流式细胞术检测发现二者在减少白血病细胞凋亡方面没有显著差异(P>0.05);7.通过Transwell小室实验,发现与空白对照组和未处理的MSCs相比,获得CAF表型的MSCs显著地促进白血病细胞的迁移和侵袭(P<0.05);8.体内动物实验中,获得CAF表型的MSCs较未处理的MSCs明显地促进白血病细胞在小鼠体内的生长和增殖(P<0.05);9.SDF-1/CXCR4信号轴作为促进基质细胞与肿瘤细胞之间相互作用的信号轴,向transwell小室中加入CXCR4抑制剂AMD3100能够使获得CAF表型的MSCs对ALL细胞迁移和侵袭的促进作用减弱(P<0.05);通过扫描电镜观察三维细胞培养体系中的细胞发现,相对于未处理组,AMD3100能够减少Nalm-6/RS4;11细胞对获得CAF表型的MSCs的黏附;10.在获得CAF表型的MSCs与Nalm-6/RS4;11细胞的共培养体系中应用AMD3100能够减少白血病细胞中整合素α5和β1的表达(P<0.05),进一步下调白血病细胞中的整合素β1能够减少获得CAF表型的MSCs对ALL细胞迁移和侵袭的促进作用(P<0.05)。结论:1.CAF标志物α-SMA和FAP的表达水平与B-ALL病程进展相关;2.BM-MSCs与B-ALL细胞株的共培养可促使BM-MSCs获得CAF表型,后者通过与白血病细胞相互作用,显著地促进了白血病细胞的迁移和侵袭;并在体内促进白血病细胞的生长和增殖;3.TGF-β可能是B-ALL微环境中促使MSCs获得CAF表型的关键因子;4.SDF-1/CXCR4轴在介导获得CAF表型的MSCs和B-ALL细胞的相互作用中起着重要的作用;5.阻断SDF-1/CXCR4轴或靶向整合素β1可能是阻止白血病细胞与获得CAF表型的MSCs之间相互作用的有效干预手段。