急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)是一种临床综合征,主要表现为急性低氧性呼吸衰竭,胸片示双侧肺浸润影,心脏充盈压正常。肺损伤可引起与死亡率增加相关的呼吸功能衰竭和多器官功能障碍。脓毒症(细菌存在于血液和组织中)是ALI/ARDS最重要的原因。脂多糖(LPS)在启动炎症反应和全身炎症反应综合征(SIRS)和脓毒症(Sepsis)中发挥重要作用。利用LPS复制ALI的动物模型进行研究是科研工作中的常用手段之一。ALI的发病机制尚未完全清楚。研究显示细胞凋亡参与了ALI/ARDS的发病过程。H2S可能参与ALI时肺组织的细胞凋亡过程,但至今国内外尚未见H2S对LPS致大鼠ALI肺组织细胞凋亡的线粒体依赖性机制研究的有关报道。本研究拟采用透射电镜、Western blotting及基因检测等技术,在线粒体水平,从形态学、蛋白表达、基因表达等方面观察H2S对LPS致大鼠ALI肺组织细胞凋亡的影响,探讨其作用机制。并进一步评价Na HS对LPS所致ALI/ARDS的治疗作用。进而为ALI/ARDS的治疗提供新的思路。第一部分脂多糖致大鼠急性肺损伤内源性硫化氢/胱硫醚-γ-裂解酶目的:观察LPS血症致大鼠ALI过程中H2S/CSE系统的时程性变化及关系。方法:选用雄性健康SD大鼠(280±20g)随机分为五组:①对照组;②LPS 1 h组;③LPS 3 h组;④LPS 6 h组;⑤LPS 9 h组。对照组共32只,不同时间点各8只。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠,LPS1 h、3 h、6 h和9 h组舌静脉注射LPS(5 mg/kg)。分别于给药后1 h、3h、6 h和9 h后采集各样品;检测肺系数及肺湿/干重比的变化;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-1β的变化;去蛋白法检测血浆中H2S含量、亚甲基蓝法检测肺组织CSE活性;电镜观察肺组织病理变化。结果1对照组大鼠肺系数在1 h~9 h之间未见明显变化。与对照组比较,LPS 1 h组大鼠肺系数无明显变化(P>0.05),LPS 3 h组大鼠肺系数开始明显升高(P<0.05),LPS 6 h和9 h组大鼠肺系数均升高且维持在较高水平(P<0.01)。2在1 h~9h之间,对照组大鼠肺湿/干重比未见明显变化。与对照组比较,LPS 1 h组大鼠肺湿/干重比无明显变化(P>0.05),LPS 3 h组大鼠肺湿/干重比开始明显增高(P<0.01),LPS 6 h及9 h组大鼠肺湿/干重比均增高且维持在较高水平(P<0.01)。3在1 h~9 h之间,对照组大鼠血清IL-1β浓度未见明显变化。与对照组比较,LPS 1 h组大鼠血清中IL-1β浓度明显增高(P<0.05),LPS 3h组IL-1β浓度升至高峰(P<0.01),随着时程的延长,LPS 6 h及9 h组大鼠血清IL-1β浓度较LPS 1 h组逐渐降低(P<0.01),但与对照组比较均明显增高(P<0.01)。4在1 h~9 h之间,对照组大鼠血浆,H2S含量未见明显变化。与对照组比较,LPS 1 h组大鼠血浆H2S含量未见明显变化(P>0.05),LPS3 h组大鼠血浆H2S含量明显降低(P<0.01),随时间延长LPS 6 h及9 h组大鼠血浆H2S含量均明显降低(P<0.01)。5在1 h~9 h之间,对照组大鼠血浆,肺组织CSE活性未见明显变化。与对照组比较,LPS 1 h组大鼠肺组织CSE活性未见明显变化(P>0.05),LPS 3 h组大鼠肺组织CSE活性明显降低(P<0.01),随时间延长LPS 6 h及9 h组大鼠血浆肺组织CSE活性均明显降低(P<0.01)。6透射电镜下可见,对照组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞呈立方形,表面微绒毛排列整齐,细胞结构完整清晰,细胞核大且呈椭圆形核膜完整;嗜锇性板层小体结构基本正常;线粒体结构正常。LPS 3 h、6 h、9 h组大鼠肺组织细胞线粒体肿胀、体积增大,甚至呈空泡化,线粒体嵴减少、部分嵴排列紊乱、融合或消失、甚至断裂;部分粗面内质网扩张呈池状,并出现脱颗粒现象;嗜锇性板层小体的板层结构显著融合或消失,甚至呈空泡状。结论:大鼠在舌静脉注射LPS1 h时,尚未出现肺组织结构受损及肺水肿,但血清中炎症细胞因子IL-1β已明显增高。舌静脉注射LPS3 h、6h、9h后肺损伤明显加重,IL-1β先增后降,H2S/CSE系统明显下调。提示H2S/CSE系统及IL-1β可能均参与了LPS致ALI的病生理过程。第二部分硫化氢对脂多糖致大鼠急性肺损伤肺组织细胞凋亡的影响目的:观察H2S对LPS致大鼠ALI肺细胞凋亡的影响。方法:选用雄性健康SD大鼠(280±20g)共40只,随机分为5组,每组8只,分别为①对照组;②LPS损伤组;③LPS+低剂量Na HS组;④LPS+中剂量Na HS组;⑤LPS+高剂量Na HS组。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠,LPS损伤组舌静脉注射LPS(5 mg/kg),LPS+低、中、高剂量Na HS组分别于舌静脉注射LPS(5 mg/kg)3 h时腹腔注射0.78mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的Na HS(均为2 ml/kg,用前半小时生理盐水新鲜配置),对照组舌静脉注射等容量的生理盐水。各组大鼠均于给予LPS或生理盐水6 h时处死。应用流式细胞术(FCM)检测肺组织细胞的凋亡。结果:对照组大鼠肺组织细胞凋亡率为21.81±2.17%,与对照组比较,LPS损伤组大鼠肺组织细胞的凋亡率明显增高(P<0.01);与LPS损伤组比较,LPS+低、中、高剂Na HS量组大鼠肺组织细胞的凋亡率明显减低(P<0.01)。结论:LPS所致大鼠ALI肺组织细胞凋亡率明显增加,给予Na HS后,肺组织细胞凋亡率明显降低,并呈剂量依赖关系。第三部分硫化氢对脂多糖致大鼠急性肺损伤肺组织细胞凋亡相关因子目的:观察H2S对LPS致大鼠急性肺损伤肺组织细胞凋亡因子的影响。方法:选用雄性健康SD大鼠(280±20g)共40只,随机分为5组,每组8只,分别为①对照组;②LPS损伤组;③LPS+低剂量Na HS组;④LPS+中剂量Na HS组;⑤LPS+高剂量Na HS组。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠,LPS损伤组舌静脉注射LPS(5 mg/kg),LPS+低、中、高剂量Na HS组分别于舌静脉注射LPS(5 mg/kg)3 h时腹腔注射0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的Na HS(均为2 ml/kg,用前半小时生理盐水新鲜配置),对照组舌静脉注射等容量的生理盐水。各组大鼠均于给予LPS或生理盐水6 h时处死。应用Western blotting法检测肺组织caspase-3、caspase-9,bcl-2、bax,Smac/DIABLO的表达变化。通过实时荧光定量反转录PCR法检测肺组织caspase-3、caspase-9,bcl-2、bax,Smac/DIABLO基因的表达变化。结果1肺脏组织caspase-3和caspase-9蛋白表达的变化Western blotting检测结果显示,对照组大鼠肺组织仅有少量的caspase-3蛋白的表达;LPS组caspase-3蛋白表达较对照组明显增强(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织caspase-3蛋白表达明显均减弱(P<0.01),同时,随Na HS的剂量加大,减低的更明显。对照组大鼠肺组织仅有少量的caspase-9蛋白的表达;LPS组caspase-9蛋白表达较对照组明显增强(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织caspase-9蛋白表达明显均减弱(P<0.01),同时,随Na HS的剂量加大,减弱的更明显。2肺脏组织bcl-2和bax蛋白的表达变化Western blotting检测结果显示,对照组大鼠肺组织仅有少量的bcl-2蛋白的表达。LPS组大鼠肺组织bcl-2蛋白表达较对照组明显增强(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织bcl-2蛋白表达明显均增强(P<0.01),同时,随Na HS的剂量加大,增强的更明显;对照组大鼠肺组织仅有少量的bax蛋白的表达。LPS组bax蛋白表达较对照组明显增强(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织bax蛋白表达明显均减弱(P<0.05或P<0.01),同时,随Na HS的剂量加大,减弱的更明显。LPS组bcl-2/bax较对照组明显减小(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织bcl-2/bax均增大(P<0.01),同时,随Na HS的剂量加大,增大的更明显。3肺脏组织Smac/DIABLO蛋白的表达变化Western blotting检测结果显示,对照组大鼠肺组织仅有少量的Smac/DIABLO蛋白的表达;LPS组Smac/DIABLO蛋白表达较对照组明显增强(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织Smac/DIABLO蛋白表达明显均减弱(P<0.01),同时,随Na HS的剂量加大,减弱的更明显。4肺脏组织caspase-3、caspase-9 m RNA的表达变化实时荧光定量反转录PCR法检测结果显示,对照组大鼠肺组织caspase-3的m RNA表达水平较低;LPS组caspase-3的m RNA表达水平较对照组明显增高(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织caspase-3的m RNA表达水平明显均减低(P<0.01),同时,随Na HS的剂量加大,减低的更明显;对照组caspase-9的m RNA表达水平较低;LPS组caspase-9的m RNA表达水平较对照组明显增高(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组大鼠肺组织caspase-9的m RNA表达水平变化不明显,LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织caspase-9的m RNA表达水平明显均减低(P<0.05或P<0.01)。5肺脏组织bcl-2、bax m RNA的表达变化实时荧光定量反转录PCR法检测结果显示,对照组大鼠肺组织bcl-2的m RNA表达水平较低;LPS组bcl-2的m RNA表达水平较对照组明显增高(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织bcl-2的m RNA表达水平明显均增高(P<0.01),同时,随Na HS的剂量加大,增高的更明显;对照组大鼠肺组织bax的m RNA表达水平较低;LPS组bax的m RNA表达水平较对照组明显增高(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织bax的m RNA表达水平明显均减低(P<0.05或P<0.01),同时,随Na HS的剂量加大,减低的更明显。6肺脏组织Smac/DIABLO m RNA的表达变化实时荧光定量反转录PCR法检测结果显示,对照组大鼠肺组织Smac/DIABLO的m RNA表达水平较低;LPS组大鼠肺组织Smac/DIABLO的m RNA表达水平较对照组明显增高(P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺组织Smac/DIABLO的m RNA表达水平明显均减低(P<0.01),同时,随Na HS的剂量加大,减低的更明显。结论:LPS导致ALI给予Na HS,caspase-3、caspase-9、bax及Smac/DIABLO蛋白表达减弱,bcl-2蛋白表达增强,caspase-3、caspase-9、bax及Smac/DIABLO m RNA表达减弱,bcl-2 m RNA表达增强,肺组织细胞凋亡降低。第四部分硫化氢对脂多糖致大鼠急性肺损伤线粒体凋亡相关途径的影响目的:观察H2S对LPS致大鼠ALI线粒体凋亡途径的影响。方法:选用雄性健康SD大鼠(280±20g)共40只,随机分为5组,每组8只,分别为①对照组;②LPS损伤组;③LPS+低剂量Na HS组;④LPS+中剂量Na HS组;⑤LPS+高剂量Na HS组。腹腔注射10%水合氯醛350 mg.kg-1麻醉大鼠,LPS损伤组舌静脉注射LPS(5 mg/kg),LPS+低、中、高剂量Na HS组分别于舌静脉注射LPS(5 mg/kg)3 h时腹腔注射0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的Na HS(均为2 ml/kg,用前半小时生理盐水新鲜配置),对照组舌静脉注射等容量的生理盐水。各组大鼠均于给予LPS或生理盐水6 h时处死,迅速取出肺组织,匀浆器混匀后,各组分别提取细胞胞浆蛋白及线粒体蛋白、定量,应用Western blotting法检测肺组织胞浆及线粒体内Cyt C及AIF的表达。结果1肺脏组织胞浆内及肺组织线粒体内Cyt C蛋白表达的变化Western blotting检测结果显示,对照组大鼠肺脏组织胞浆内仅有少量的Cyt C蛋白表达,肺脏组织线粒体内有大量的Cyt C蛋白表达;LPS组大鼠肺脏组织胞浆内Cyt C蛋白表达较对照组明显增强,肺脏组织线粒体内的Cyt C蛋白表达较对照组明显减弱(P<0.05或P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺脏组织胞浆内Cyt C蛋白的表达明显减弱,肺脏组织线粒体内Cyt C蛋白的表达明显增强(P<0.05或P<0.01)。2肺脏组织胞浆内及肺组织线粒体内AIF蛋白表达的变化Western blotting检测结果显示,对照组大鼠肺脏组织胞浆内仅有少量的AIF蛋白表达,肺脏组织线粒体内有大量的AIF蛋白表达;LPS组大鼠肺脏组织胞浆内AIF蛋白表达较对照组明显增强,肺脏组织线粒体内的AIF蛋白表达较对照组明显减弱(P<0.05或P<0.01)。与LPS组比较,LPS+低剂量Na HS组、LPS+中剂量Na HS组、LPS+高剂量Na HS组大鼠肺脏组织胞浆内AIF蛋白的表达明显减弱,肺脏组织线粒体内AIF蛋白的表达明显增强(P<0.05或P<0.01)。结论:在LPS导致ALI给予Na HS,大鼠肺脏组织胞浆内Cyt C蛋白及AIF蛋白的表达明显减弱,线粒体内Cyt C蛋白及AIF蛋白的表达明显增强,肺组织细胞凋亡降低。第五部分硫化氢对脂多糖致大鼠急性肺损伤肺组织细胞线粒体的影响目的:观察H2S对LPS致大鼠ALI肺脏线粒体结构与功能的影响。方法:选用雄性健康SD大鼠(280±20g)共40只,随机分为5组,每组8只,分别为①对照组;②LPS损伤组;③LPS+低剂量Na HS组;④LPS+中剂量Na HS组;⑤LPS+高剂量Na HS组。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠,LPS损伤组舌静脉注射LPS(5 mg/kg),LPS+低、中、高剂量Na HS组分别于舌静脉注射LPS(5 mg/kg)3 h时腹腔注射0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的Na HS(均为2 ml/kg,用前半小时生理盐水新鲜配置),对照组舌静脉注射等容量的生理盐水。各组大鼠均于给予LPS或生理盐水6 h时处死,迅速取出肺组织,匀浆器混匀后,低温差速离心法提取肺脏组织线粒体,测定线粒体总ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量及线粒体肿胀度、活力;电镜观察大鼠肺脏组织线粒体超微结构的改变。结果1透射电镜下肺脏组织细胞形态学的改变透射电镜下观察显示,对照组大鼠肺脏组织细胞线粒体、粗面内质网等结构基本正常,嗜锇性板层小体数目、结构基本正常。与对照组比较,LPS损伤组大鼠肺脏组织超微结构明显受损,线粒体肿胀、嵴减少或消失,嗜锇性板层小体板层结构显著融合或消失,粗面内质网脱颗粒现象明显。LPS+低剂量Na HS组大鼠肺脏组织超微结构与LPS损伤组比较,损伤程度有所减轻。与LPS组比较,LPS+中、高剂量Na HS组大鼠肺脏组织超微结构损伤程度明显减轻。2肺组织细胞线粒体MDA含量、SOD、GSH-PX和ATPase活性的变化与对照组比较,LPS损伤组大鼠肺脏组织细胞线粒体MDA含量明显增高,SOD、GSH-PX和ATPase活性明显减低(P<0.01)。与LPS损伤组比较,LPS+低、中、高剂量Na HS组大鼠肺脏组织细胞线粒体MDA含量明显减低,SOD、GSH-PX和ATPase活性明显增高(P<0.05或P<0.01)。3肺组织细胞线粒体活力和线粒体膜肿胀度的变化与对照组比较,LPS损伤组大鼠肺脏组织细胞线粒体膜肿胀度明显增高(OD540值明显减低),线粒体活力明显减低(P<0.01)。与LPS损伤组比较,LPS+低、中、高剂量Na HS组大鼠肺脏组织细胞线粒体膜肿胀度明显减低(OD540值明显增加),线粒体活力明显增高(P<0.05或P<0.01)。结论:LPS可导致ALI大鼠肺组织线粒体结构损伤和功能减弱,H2S可能通过减降低LPS诱导的肺组织线粒体氧化损伤,保护线粒体结构和功能,并呈明显的剂量依赖关系。