大气污染是影响公众健康的首要环境危险因素之一。大气污染物是由诸多污染物组成的复杂混合物,目前公认的各种大气污染物中,可吸入颗粒物(particulate matter, PM)与人群健康效应各终点的流行病学联系最为密切,是定量评价大气污染健康危害的标志性污染物。颗粒物,特别是空气动力学直径≤10μm的可吸入颗粒物(PM10)是国内外许多大城市的首要污染物。大量流行病学调查研究表明,可吸入颗粒物与人类呼吸系统疾病的发病率、死亡率密切相关,能引起哮喘、肺功能下降、呼吸系统炎症,甚至累及心血管系统、神经系统、免疫系统、促进癌症发生。对欧洲29个国家的调查研究表明,PM10每升高10μg／m3,呼吸系统疾病的病死率提高0.58%。德国科学家于1985-1994年对4757名妇女进行了调查研究,结果显示慢性暴露于PM10以及居住在主干道路附近的妇女肺功能受到了有害的影响,慢性阻塞性肺炎的发病率上升。在我国,对于中国现有的颗粒物暴露和死亡率关系的剂量-反应关系资料的Meta分析表明,PM10每增加10μg／m3,急性死亡率增加0.38%。对于太原市空气颗粒物与呼吸系统疾病每日住院率相关性研究发现,PM10每增加10μg／m3,呼吸系统疾病每日住院率上升0.72%-2.15%。据统计,地球上每年PM10的生成量约几十亿吨,一个成年人一昼夜会吸入约数万个甚至数十万个大气颗粒物。因此,大气污染颗粒物对人群健康的影响已成为世界各地环境、气象和医务工作者极为关注的前沿性课题。支气管哮喘(简称哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞为主的众多炎症细胞和炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病。近年来,其患病率及死亡率均呈逐年上升趋势。在一些发达国家,例如美国的儿童哮喘患病率从1980年的3.6%上升到2003年的5.8%；而我国儿童哮喘患病率也从1990年的2.03%上升到2000年的4.63%。专家警告：到2025年,如果全球人口的城市化比例从现有的45%升至59%,哮喘病患者将有可能达到4亿人,每250例死亡病例中就有1例由哮喘病导致。哮喘已经成为仅次于癌症的世界第二大致死和致残疾病,而中国已经成为全球哮喘死亡率最高的国家之一。既往流行病学调查研究表明,大气中可吸入颗粒物浓度升高与哮喘患者数量增加密切相关；在亚洲沙尘暴发生的时段中,台湾和韩国地区哮喘病的日就诊率明显增加；同时实验研究发现暴露于来源于美国洛杉矶高速公路附近的PM10能够导致卵蛋白(ovalbumin, OVA)诱导的哮喘小鼠气道炎症反应增强。因此,研究大气污染颗粒物对哮喘小鼠的损伤作用机制对加强颗粒物污染防治及敏感人群的健康保护具有重要的现实意义和指导意义。呼吸道是可吸入颗粒物的靶器官,肺巨噬细胞是呼吸道内部重要的防御屏障。在它吞噬颗粒物进行消化过程中,加速各种炎性因子的合成与释放,扰乱了细胞因子网络平衡,从而启动了炎症过程,促进炎症发展,对肺部造成损伤。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是近年来备受关注的一种病原体识别受体,主要表达于巨噬细胞和树突状细胞表面。TLRs是跨膜蛋白,通过辨认识别生物体内保守的病原相关分子模式(pathogens associated molecular patterns, PAMPs),活化巨噬细胞和树突状细胞,产生细胞因子和趋化性细胞因子,启动天然免疫应答,构成机体免疫反应的第一道防线[21]。PAMPs是广泛存在于病原体细胞表面的分子标志,如酵母细胞壁上的甘露糖,以及脂多糖、肽糖、胞壁酸等各种细菌的细胞壁成分。巨噬细胞可以通过其细胞表面表达的TLRs来识别和结合PAMPs,从而激发细胞内的信号传导,而引起机体天然免疫反应。同时TLRs与PAMP的结合还可以刺激抗原递呈细胞产生致炎细胞因子激发被动免疫。然而,其他的模式识别受体如Nod样受体(Nod-like receptors, NLRs)也参与天然免疫的介导[25]。NLRs家族的成员NALP3 (NACHT-, LRR-and pyrin-domain containing protein 3)是细胞质受体,被微生物配体肽聚糖和细胞损伤的内源性标记物(如ATP和尿酸结晶等)激活。具有活性的NALP3与衔接蛋白如凋亡相关的斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing caspase recruitment domain, ASC)结合而形成NALP3炎症复合体。该复合体激活半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1),进而分泌白细胞介素-1β(Interleukin 1β, IL-1β),促进炎症反应。本研究中应用大气污染颗粒物对小鼠巨噬细胞进行染毒,通过检测细胞中TLRs和NALP3炎症复合体的基因表达而探讨大气污染颗粒物对哮喘小鼠损伤作用的机制。在本研究中使用电子加热器将采集于我国北京空气中的城市空气颗粒物(urban particulate matte, UPM)和采集于日本壹歧岛空气中的亚洲沙尘暴浮尘颗粒物(air-borne Asian sand dust, AASD)的部分样本进行加热处理,以去除吸附于其表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。本实验中应用OVA致敏小鼠,采用气管灌注的方法,分别将加热处理的UPM (heated UPM, H-UPM)、未加热处理的UPM、加热处理的AASD (heated AASD, H-AASD)和未加热处理的AASD的悬浮液注入小鼠体内,观察小鼠肺组织病理形态学变化,支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中炎症细胞的分布变化,BALF中细胞因子和趋化性细胞因子的蛋白表达改变,以及血清中OVA特异性IgE和IgG1抗体的表达变化。体外培养小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)观察TLRs和NALP3炎症复合体的基因表达变化,从而探求北京城市空气颗粒物和亚洲沙尘暴浮尘对机体健康危害的机制。本研究是关于北京城市空气颗粒物和亚洲沙尘暴浮尘对于OVA诱导哮喘小鼠气道炎症作用的首次实验研究。实验方法1、样本处理分别将采集到的UPM和AASD样本在电子加热器中经过360℃加热处理30min,以除去吸附于颗粒物表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。2、真菌检测应用荧光显微镜和真菌菌相Y荧光染料检测UPM和AASD样本中的真菌。参照真菌菌相Y荧光染料的实验说明书,将2.5μg的样本悬浮于40μl荧光染料中,经过5 min后制作成玻璃切片,于荧光显微镜下观察。激发波长为472.5 nm,发射波长为520.0 nm。3、水溶性成份、脂多糖及β-葡聚糖的检测应用离子色谱和电感耦合等离子体-原子发射光谱分析UPM和AASD样本中的水溶性成份如SO42-和NO3-等。应用Endospec ES test MK检测UPM和AASD样本中的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)含量,应用Fungitec G test MK检测UPM和AASD样本中的β-葡聚糖含量。4、实验动物及染毒从Charles River公司(神奈川,日本)购入雄性ICR小鼠,适应性喂养一周后开始实验。每间隔一周,将小鼠在4%三氟溴氯乙烷作用下麻醉,经气管注入颗粒物(0.1 ml/mouse)和／或OVA (0.1 ml/mouse)。最后一次染毒的第二天,经小鼠腹腔注射戊巴比妥,将其深度麻醉,放血处死。5、实验动物的病理检测剖取小鼠肺部固定于10%中性福尔马林缓冲液中,肺叶分离后,将其切割成2 mm大小的碎块,用石蜡包埋,制作成3μm厚的切片。HE染色后观察呼吸道由近端向远端嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润情况。PAS染色后观察支气管上皮杯状细胞的增殖情况。应用显微镜对每个切片的炎症细胞和上皮细胞进行观察分析。6、采集支气管肺泡灌洗液和血液小鼠深度麻醉,心脏采血,离心后取上清液,-80℃C的深度冰箱中保存,用于检测血清中的OVA特异性抗体IgE和IgGl的表达；气管固定,用无菌生理盐水灌洗小鼠肺部,收集灌洗液后离心取上清液,-80℃的深度冰箱中保存,用于检测BALF中细胞因子和趋化性细胞因子的蛋白表达。7、支气管肺泡灌洗液中的细胞计数将支气管肺泡灌洗液离心后得到的沉淀溶于生理盐水中,制成细胞悬液,显微镜下应用血细胞计数器直接计数总细胞数。细胞悬液应用细胞离心涂片机,应用Diff-Quik染色,显微镜下观察计数嗜酸性粒细胞等炎性细胞。8、肺泡灌洗液中的细胞因子和趋化性细胞因子的检测应用酶联免疫反应检测BALF中细胞因子和趋化性细胞因子的蛋白表达。其中细胞因子包括：白细胞介素(Interleukin, IL)-4、IL-5、IL-12、IL-13和干扰素(interferon, IFN)-γ;趋化性细胞因子包括：角质细胞趋化因子(Keratinocyte chemoattractant, KC)、巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein, MIP)-1α单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein, MCP)-1、MCP-3、调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子(regulated on activation normal T cell expressed and presumably secreted, RANTES)和嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)。9、OVA特异性IgE和IgG1抗体的检测应用鼠OVA-IgE ELISA试剂盒和鼠OVA-IgG1 ELISA试剂盒检测血清中的OVA特异性IgE和IgGl抗体。10、细胞培养及染毒本研究中采用由BALB/c雄性小鼠中提取的巨噬细胞系RAW264.7。将加热、未加热的UPM和AASD样本分别配置成DMEM悬浮液,使其浓度均为3 mg/ml,观察细胞生长状态良好。每个培养皿中加入40μl的UPM或AASD悬浮液,使其终浓度为30μg/ml,在含5%CO2的37℃培养箱中,培养3 h后提取RNA。11 RT-PCRISOGEN提取RNA后,冰上操作反转录获得cDNA,进行RT-PCR分析TLRs和NALP3炎症复合体的基因表达。12、统计学分析本研究应用SPSS13.0统计学软件进行分析,统计结果表述为平均数±标准差,采用单因素方差分析比较不同染毒组的实验数据；当组间差异具有统计学意义时,采用SNK法进行组间比较,p<0.05具有统计学意义。实验结果1、附着于颗粒物表面的真菌检测在未加热的UPM和AASD表面明显呈现荧光,该现象表明未经过加热处理的颗粒物表面吸附了真菌微生物。2、颗粒物中化学成分、水溶性成分、脂多糖和β-葡聚糖的含量UPM中的主要化学成分为二氧化硅(约占32%)和碳(约占12%)。AASD中的主要化学成分为二氧化硅(约占60%)。UPM和AASD均含有一定量的SO42-、NO3-、Cl-、NH4+、LPS和β-葡聚糖；而经过加热处理的UPM和AASD中上述水溶性成分、LPS和β-葡聚糖的含量均未检测到。3、颗粒物致小鼠肺部病理学改变的观察OVA+UPM和OVA+AASD联合处理组的小鼠肺支气管上皮中杯状细胞显著增殖,在PAS反应中呈现粉色,呼吸道周围结缔组织中有明显的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润,其病理学改变分别强于OVA+H-UPM和OVA+H-AASD联合处理组。4、颗粒物对小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞分布的影响OVA+UPM和OVA+AASD联合处理组小鼠的支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及淋巴细胞数量显著高于其他各处理组。5、颗粒物对小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子和趋化性细胞因子表达的影响与OVA单独处理组相比,OVA+UPM和OVA+AASD联合处理组小鼠的支气管肺泡灌洗液中细胞因子IL-4、IL-5、IL-12和趋化性细胞因子MCP-1、MCP-3、嗜酸性粒细胞趋化因子的蛋白表达显著增加。6、颗粒物对小鼠血清中OVA特异性IgE和IgG1表达的影响与OVA单独处理组相比,OVA+UPM和OVA+AASD联合处理组小鼠的血清中OVA特异性IgE和IgG1抗体的表达明显增加。7、颗粒物对鼠巨噬细胞中TLR2和TLR4 mRNA表达的影响与对照组相比,AASD使小鼠巨噬细胞中TLR2表达mRNA显著增加,而TLR4表达mRNA显著减少,H-AASD处理组的mRNA表达无显著变化。8、亚洲沙尘暴浮尘颗粒物对小鼠巨噬细胞中NALP3炎症复合体mRNA表达的影响与对照组相比,AASD使小鼠巨噬细胞中NALP3炎症复合体的基因表达显著增加,H-AASD处理组NALP3炎症复合体的基因表达无显著变化。结论1、北京城市空气颗粒物和亚洲沙尘暴浮尘颗粒物通过增加Th2反应相关的细胞因子和趋化性细胞因子的表达而激活Th2免疫反应,进而加重OVA诱导哮喘小鼠的气道炎症反应；城市空气颗粒物和亚洲沙尘暴浮尘中的二氧化硅成分以及吸附于颗粒物表面的燃料燃烧产物、真菌、细菌可能在上述反应过程中发挥重要作用。2、亚洲沙尘暴浮尘颗粒物导致小鼠巨噬细胞中TLR2和NALP3炎症复合体基因表达增加。