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目的： 二十羟-二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE)，是花生四烯酸在细胞色素P450(CYP)4A和4F酶代谢生成的重要活性物质，其在调节血管张力和肾脏水钠平衡中具有极其重要的作用，与高血压发生发展密切相关。临床上高血压、高血糖常常并发，在一些高血压动物模型中，学者们发现20-HETE含量升高的同时伴随高血糖症和高胰岛素血症;在一些糖尿病动物模型中也检测到20-HETE水平的改变。此外，Tsai等在人类代谢综合征（高血压、高血糖、高血脂和肥胖）患者发现其血浆和尿液中20-HETE水平明显增高;而且在瑞典人群中也发现CYP4F2 V433M多态与代谢综合征密切相关。在我们的CYP4F2转基因小鼠中20-HETE已经表现出了促高血压作用，那么20-HETE是否也会参与血糖的调节昵？其具体机制又是什么？ 此前我们成功的在FVB/N小鼠中建立了由肾脏雄激素调节蛋白(kidneyandrogen-regulated protein，KAP)作为启动子的CYP4F2转基因小鼠，并证明了转基因小鼠肾脏CYP4F2高表达，尿20-HETE排泄增加，呈现高血压表型。但是如果我们把FVB/N小鼠换成比其具有更低20-HETE遗传背景的BCF1小鼠，把KAP换成能使目的基因在各组织广泛有效表达的巨细胞病毒(cytomegalovirus; CMV)启动子，使CYP4F2广泛表达于各组织，那么CMV-CYP4F2转基因小鼠在多种组织和器官是否具有更高水平的20-HETE，它的血压、血糖会不会高于KAP-CYP4F2转基因小鼠呢？ 本研究凭借CYP4F2转基因小鼠模型这一研究平台，深入探讨20-HETE对血糖、血压的调节作用及具体机制。 材料与方法： 一、实验材料: 1.CYP4F2转基因小鼠 2.人Be17402细胞系 3.Western blot、免疫共沉淀相关试剂 4.Real-time PCR相关试剂 5.血糖、胰岛素等检测相关试剂 6.刺激药物:HET0016、20-HETE 7.LC-MS相关试剂 二、实验方法: 1.测量小鼠空腹血糖及胰岛素等生化指标。 2.LC-MS检测小鼠血、尿及肝肾组织20-HETE水平。 3.酶活试剂盒检测小鼠肝脏组织糖原磷酸化酶(GP)、PKA及腺甘酸环化酶(AC)活性，ELISA检测cAMP水平。 4.提取小鼠组织总蛋白并定量，免疫沉淀(P)及Western blot检测磷酸化激酶(PhK)与GP的磷酸化水平及胰岛素受体底物1(IRS-1)酪氨酸、丝/苏氨酸磷酸化水平。 5.提取小鼠肝脏脂肪、骨骼肌、肝脏浆蛋白及膜蛋白并定量，Western blot检测葡萄糖转运子(GLUTs)在不同部位的表达。 6.应用20-HETE抑制剂HET0016处理转基因小鼠，检测小鼠血糖、血压及cAMP/PKA-PhK-GP途径的改变。 7.培养Bel-7402细胞，添加20-HETE刺激，检测cAMP/PKA-PhK-GP途径的改变及IRS1酪氨酸、丝/苏氨酸磷酸化水平和GLUTs在胞浆胞膜的表达。 8.构建CMV-CYP4F2转基因小鼠。 9.Western blot检测CYP4F2在各组织的表达及比较CYP4F2在CMV-CYP4F2及KAP-CYP4F2转基因小鼠肝肾中的表达。 10.检测两种转基因小鼠血压与血糖，比较两种转基因小鼠表型的差异。 11.提取小鼠肾脏、肝脏总RNA，反转录成cDNA，Real-time PCR检测Cyp4amRNA表达。 结果： 一、20-HETE在CYP4F2转基因小鼠中升高血糖的机制研究 1.转基因小鼠空腹血糖明显高于野生型小鼠（8.4±1.86 vs.4.9±1.23 mM），胰岛素水平与野生型小鼠并无明显差别(4.9±0.25 vs.4.8±0.19 mU/L)。 2.转基因小鼠GP活性明显升高，是野生型小鼠的3.5倍;与此同时，小鼠肝脏GP活性与空腹血糖呈明显的正相关。 3.HET0016处理后，转基因小鼠空腹血糖及GP活性明显下降。 4.转基因小鼠cAMP水平及PKA活性明显高于野生鼠，PhK及GP的丝/苏氨酸磷酸化水平明显增高，可见转基因小鼠肝脏cAMP/PKA-PhK-GP途径明显被激活，且在用HET0016处理后，该途径活性显著下降。 5.培养细胞，结合PKA抑制剂及AC抑制剂处理细胞，体外实验证实20-HETE可以通过cAMP/PKA-PhK-GP途径激活GP。 6.转基因小鼠脂肪、骨骼肌及肝脏中IRS-1酪氨酸磷酸化水平均增强，而其丝/苏氨酸磷酸化水平均有不同程度的降低，GLUT4在三个组织的胞浆及胞膜表达均上调，肝脏中GLUT1在不同部位的表达也均出现上调。证实转基因小鼠胰岛素信号通路并未受损反而有所增强。 7.培养细胞发现20-HETE刺激后，细胞中IRS-1酪氨酸和丝/苏氨酸磷酸化水平均无明显改变。与此同时，GLUT1及GLUT4在细胞浆及细胞膜的表达并无明显改变。体外实验证实20-HETE对胰岛素信号通路并无明显的作用。 二、转基因小鼠CMV-CYP4F2与KAP-CYP4F2的特性分析 1.PCR等方式鉴定CMV-CYP4F2转基因小鼠显示构建成功。 2.CYP4F2在CMV-CYP4F2转基因小鼠肝脏中高表达，在其他组织中如肾脏表达很弱，而KAP-CYP4F2转基因小鼠肾脏高表达CYP4F2，其他组织如肝脏有着不同程度的表达;此外，CMV-CYP4F2转基因小鼠雌雄差异不明显，而KAP-CYP4F2转基因小鼠受雄性激素影响较大，雄鼠的表达强于雌鼠。 3.CYP4F2在KAP-CYP4F2转基因小鼠肾脏的表达远远高于CMV-CYP4F2转基因小鼠;在两种转基因鼠肝脏中均有较高表达。 4.在CMV-CYP4F2转基因鼠中，只有肝脏的20-HETE水平升高，是野生型小鼠的2倍，而20-HETE在其他组织中并无明显差异。20-HETE在KAP-CYP4F2转基因小鼠各组织中均升高，在尿液、肾脏、血浆及肝脏中均出现不同程度的上升。 5.CMV-CYP4F2转基因小鼠血压、血糖无明显改变;KAP-CYP4F2转基因小鼠呈现高血压、高血糖表型。 6.在肾脏中，外源的CYP4F2抑制了KAP-CYP4F2转基因小鼠肾脏内源性Cyp4a家族的表达;而在两种转基因鼠肝脏组织中Cyp4a家族并未受到外源性CYP4F2基因的影响。 结论： 1.20-HETE通过激活cAM/PKA-PhK-GP途径导致肝糖原分解增强，是其升高血糖的重要机制，20-HETE并不影响胰岛素的功能。 2.CYP4F2在肾脏中过表达引起的高20-HETE，是导致高血压的重要原因，在肾外组织的高表达不能引起血压改变。