背景与目的:新近研究发现糖尿病患者易患细菌感染、大血管并发症以及微血管并发症,这些均与中性粒细胞的数量和质量的改变有关。中性粒细胞是机体抗感染免疫的第一道防线,糖尿病时中性粒细胞的功能明显受损,因此,中性粒细胞功能肯定受高血糖的影响。血糖控制在预防感染方面至关重要,但旨在研究危重病人血糖控制的NICE-SUGAR研究和预防糖尿病大血管事件的ACCORD研究均没有发现实现血糖“正常化”可减少全因死亡。但是,当前尚没有研究探讨糖尿病时血糖到底控制在何种水平既安全、不影响中性粒细胞功能,又避免中性粒细胞在杀伤病原微生物的同时不对机体造成损伤。本实验用人类早幼粒细胞性白血病细胞株(HL-60)细胞作为研究的模型,来研究不同血糖浓度状态下胰岛素浓度及外源性炎性因子脂多糖对中性粒细胞的吞噬功能和ROS的产生的影响,以找到适合临床上血糖控制的安全范围。方法:1.细胞培养人类早幼粒细胞性白血病细胞株HL-60(大连医科大学检验医学院实验室提供)。将HL-60细胞置入含有的10%胎牛血清的RPMI 1640(5.0 mmol/L葡萄糖)培养液中,放置于37℃,5%CO2的孵育箱中培养。并在对数生长期收获细胞,使细胞达到同步化后加入不同的实验处理因素。2.实验分组1)本实验分别用不同水平的葡萄糖浓度对HL-60细胞进行培养(3.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、15.0、20.0 mmol/L、其中设置20.0 mmol/L甘露醇作为渗透压对照组),细胞于37℃,5%CO2的孵育箱中培养72h后,收获细胞。2)实验各组细胞再分别用不同浓度的胰岛素进行对抗(0 mIU/L、相当于生理浓度20 mIU/L、相当于应激浓度50 mIU/L、相当于高浓度胰岛素1000 mIU/L),细胞于37℃,5%CO2的孵育箱中培养24h后收获细胞。3)HL-60细胞在160 nmol/L的12-豆蔻酰及13-乙酸,佛波醇(PMA)诱导分化24h后,细胞具有吞噬能力,用于检测吞噬功能。4)实验各组细胞置于有外源性刺激因子LPS(10μg/ml)和无LPS(0μg/ml)的条件中,刺激8h后收获细胞,检测HL-60细胞的吞噬的功能和氧化应激ROS产生的多少情况并进行单因素方差分析和秩和检验,结果进行比较。结果:1.葡萄糖、LPS及胰岛素对HL-60细胞吞噬能力的影响(1)HL-60细胞吞噬功能从葡萄糖5.0 mmol/L起逐渐增强,至8.0 mmol/L达到高峰显著增强(P<0.05),至10.0 mmol/L回到基线水平。(2)培养液中存在10μg/ml脂多糖(LPS)时,HL-60细胞的吞噬功能在葡萄糖浓度为3.5 mmol/L时最强,与5.0 mmol/L葡萄糖时相比差异有统计学意义(P<0.05),葡萄糖浓度从5.0 mmol/L至20.0 mmol/L没有观察到对细胞吞噬功能的影响。(3)培养液中加入不同浓度胰岛素后,HL-60细胞的吞噬功能呈下降趋势,且与胰岛素浓度升高没有明显关系。胰岛素能够抑制葡萄糖引起的HL-60细胞吞噬功能增强。葡萄糖浓度为5.0～10.0 mmol/L时,胰岛素对葡萄糖引起的细胞吞噬功能抑制最明显(P<0.05),而10.0 mmol/L葡萄糖以后细胞吞噬功能减弱的不明显。(4)培养液中存在10μg/ml脂多糖(LPS)时,并在孵育葡萄糖的同时加入相当于生理浓度的胰岛素(20 mIU/L)、相当于应激浓度的胰岛素(50 mIU/L)和相当于高胰岛素(1000 mIU/L),与未加入胰岛素时相比,炎症因子存在能够使HL-60细胞的吞噬功能增强,胰岛素浓度对HL-60细胞的吞噬功能没有明显影响,但仍旧存在一定程度的抑制作用。2.葡萄糖、LPS及胰岛素对HL-60细胞产生ROS的影响(1)HL-60细胞产生的ROS的能力从葡萄糖浓度5.0 mmol/L至20.0 mmol/L均没有明显改变。(2)当培养液内有葡萄糖与10μg/ml脂多糖(LPS)共同培养时,HL-60细胞产生ROS的能力于各个葡萄糖浓度均显著增加(P<0.05)。(3)培养液中加入不同浓度胰岛素时,HL-60细胞产生的ROS与未加入胰岛素相比,相当于生理浓度胰岛素(20 mIU/L)和相当于应激浓度胰岛素(50 mIU/L)时,HL-60细胞产生的ROS没有明显影响,而高浓度胰岛素(1000 mIU/L)可以明显增加HL-60细胞ROS的产生(P<0.05)。(4)培养液中存在10μg/ml脂多糖(LPS)时,炎症因子的存在能使HL-60细胞产生ROS明显增加,孵育葡萄糖的同时加入相当于生理浓度的胰岛素(20 mIU/L)、中等浓度的胰岛素(50 mIU/L)时,与未加入胰岛素时相比,HL-60细胞产生的ROS没有明显增加,但加入高浓度胰岛素(1000 mIU/L)时,HL-60细胞释放的ROS明显降低(P<0.05),几乎回到了未加入炎症因子LPS时的基线水平。结论:在相当于胰岛素缺乏的条件下,中性粒细胞的吞噬功能血糖浓度5.0～10.0mmol/L时最强。在相当于无细菌感染的条件下,高胰岛素血症对中性粒细胞产生ROS无影响,但可以抑制血糖浓度5.0～10.0 mmol/L、胰岛素缺乏情况下所观察到的吞噬功能增强的作用。在相当于机体遭受感染及胰岛素缺乏状态下,中性粒细胞产生ROS的作用显著增强,但其吞噬能力无改变;在生理及一般应激性胰岛素条件下,中性粒细胞产生ROS能力及其吞噬能力与相当于胰岛素缺乏状态时没有差异;但极度高浓度胰岛素可过抑制相当于感染状态下中性粒细胞产生ROS能力增强的情况,对中性粒细胞的吞噬能力无影响。因此,5.0～10.0mmol/L的血糖水平波动可能是糖尿病病人的可以接受的控制范围。