论文部分内容阅读
有足够的证据表明,长期过量饮酒会造成机体的严重损伤,尤其对于肝脏组织更是如此。肝脏线粒体是酒精代谢的主要场所,也是酒精中毒所直接损伤的亚细胞器。有关酒精生物学的另一个问题是,适量饮酒是否也会损害健康?这方面的看法似乎莫衷一是,立场迥异。本研究试图以大鼠肝脏线粒体为研究材料,系统研究在适量酒精喂养所引起的线粒体蛋白质组的改变。
我们采用适量的酒精喂食大鼠12周,而后取其心脏、肾脏和肝脏组织,并利用Nycodenz密度梯度离心技术分离相应的组织中的线粒体。线粒体的蛋白质经2DE分离之后,通过电泳图谱分析获得了酒精喂养大鼠组织的线粒体中显著变化的电泳斑点,我们运用MALDI-Tof/Tof MS技术鉴定了这些差异斑点。相对于对照组,酒精喂食组大鼠肝脏线粒体的蛋白质表现出较多的变化,然而心脏和肾脏线粒体的蛋白质则相对稳定。这提示,即使在短期和低浓度酒精喂食条件下,肝脏仍然是一个对于酒精相当敏感的组织器官。颇为意外的是,所鉴定的肝脏线粒体蛋白质中的50%是醛酮还原酶超家族的成员(AKRs)。
一般认为,AKR是一个胞浆蛋白质,参与了一系列代谢产物的醇化反应。为了证实AKR蛋白质可能也存在于肝脏线粒体内,我们从正常大鼠中分离了新鲜的心脏,肾脏和肝脏样本,制备了较为完全分离的组织线粒体,再结合了酶学测定和Westemblot检测胞浆和线粒体内的AKR的活性和表达丰度。实验结果支蛋白质组分析的结论,即AKR蛋白质只分布于肝脏的线粒体内,而在心脏和肾脏线粒体内基本无法检测到AKR蛋白质。我们进一步用激光共聚焦显微镜方法验证培养的肝脏细胞中AKR的分布,线粒体标志物和AKR抗体的重叠图像显示,虽然大部分AKR蛋白质的确位于胞浆处,但是在线粒体内也是能够观察到AKR的信号的。
根据蛋白质组的数据,我们假设AKR蛋白质在酒精存在的条件下可能发生亚细胞器之间的位移。为了证明这一假设,我们首先用适量的酒精处理肝脏细胞,然后制备肝脏细胞的线粒体,并以Westemblot方法检测AKR在线粒体内外的丰度。实验结果表明,酒精确促使线粒体中AKR的丰度下降。我们进一步建立了带有GFP荧光标签和线粒体定位引导肽段的重组AKR质粒,将该质粒转染至肝脏细胞后,用Westemblot确证AKR蛋白质是否可以表达于线粒体中,而后我们用酒精处理转染的AKR的肝脏细胞,在激光共聚焦显微镜下观察AKR可能出现的亚细胞位移。