目的与背景肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,发病率增长迅速,近80%以上的肺癌为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),尽管手术切除是早期NSCLC最有效的治疗方法,但60%的患者到医院就诊时,已经属于晚期,失去了外科手术和多学科根治的最佳时机,手术病人的术后复发率高,因此化疗成为治疗肺癌的主要手段。由于NSCLC细胞具有化疗抵抗性或在化疗过程中产生抵抗,NSCLC的预后很差,一年存活率仅为30～35%。研究表明:细胞凋亡的阻断是肺癌化疗抵抗的一种重要机制。许多化疗药物通过损伤DNA诱导细胞凋亡起作用,肿瘤抑癌基因p53是极为重要的调节分子,p53基因缺失或突变导致的p53介导的细胞凋亡功能缺陷是非小细胞肺癌等对损伤DNA的化疗药物抵抗的重要机制。p53细胞凋亡功能的刺激蛋白(ASPP,apoptosis-stimulating protein of p53)是p53介导的细胞凋亡功能的调节蛋白,ASPP不仅能够特异性激活p53的细胞凋亡功能,也能激活p53同组蛋白p63和p73的细胞凋亡功能,因而对表达和不表达p53的肿瘤细胞的凋亡有调节作用。野生型p53是一个肿瘤抑制蛋白,对肿瘤的发生、发展是通过诱导细胞发生凋亡或阻滞细胞周期。但为什么在未发生p53突变时仍然发生恶性肿瘤, p53不能抑制肿瘤细胞的生长?研究发现野生型p53的功能受到ASPP1、ASPP2调节,它们与p53结合形成ASPP- p53复合物作用于原凋亡基因(如Bax、Fax、PIG3),通过提高原凋亡基因的活力促进p53依赖的细胞凋亡作用,野生型p53的功能丧失可能与ASPP1、ASPP2表达改变有关。目前,对于ASPP家族与肿瘤的关系,尤其是ASPP家族与非小细胞肺癌的认知多来源于体外实验,对非小细胞肺癌患者癌组织以及非小细胞肺癌患者化疗时ASPP表达的变化研究,国内尚未见报道。因此,本研究探讨了p53遗传背景不同的非小细胞肺癌细胞株中p53促凋亡刺激蛋白ASPP家族的表达和化疗药物作用非小细胞肺癌细胞株后ASPP表达的调节,以及非小细胞肺癌癌组织、癌旁组织,正常肺组织中p53不同状态下ASPP表达的变化,非小细胞肺癌患者化疗过程中监测外周血ASPP表达的临床意义。通过本研究探讨ASPP的表达与非小细胞肺癌发生的相关性,以及化疗药物对ASPP表达的影响,为非小细胞肺癌的诊断和治疗寻找新的分子靶点。材料和方法细胞标本选取肺鳞癌细胞株NCI-H157, p53突变型;肺腺癌细胞株A549,p53野生型。组织标本选自2007年2月至12月本院的非小细胞肺癌手术切除癌组织、癌旁组织(癌组织旁1-2cm内组织)、肺组织(癌组织边缘外2cm)各37例。其中男性患者21例,女性患者16例,平均年龄61岁,年龄分布于38-75岁;诊断为肺腺癌15例,鳞癌为16例,其它非小细胞巨细胞癌2例和肺腺癌鳞癌分化4例。血液标本来自上述NSCLC患者,收集化疗前后的血液标本,其中追踪调查18例病例。对照组为健康体检者,男性19例,女性18例,平均年龄51岁,年龄分布44-71岁。1.ASPP1标准品选取通过转录得到的高浓度质粒,ASPP2的标准品通过培养HL-60细胞,提取RNA转录获得的cDNA,根据已知序列设计特异性引物,建立检测p53凋亡刺激蛋白ASPP1和ASPP2 mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法;2.应用实时荧光定量RT-PCR方法检测肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织ASPP表达,免疫组化检测肺癌组织p53表达状态;3.选择p53遗传背景不同的非小细胞肺癌细胞株NCI-H157(突变型)和A549(野生型)进行培养,用化疗药物顺铂(cisplatine)处理,采用MTT法筛选化疗药物敏感细胞株,利用透射电镜检查NSCLC细胞株的形态学改变。应用实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌细胞株ASPP的表达,比较不同细胞株之间和药物处理后ASPP表达的差异;4.检测非小细胞肺癌患者外周血ASPP的表达,并与对照组比较,以及监测非小细胞肺癌患者化疗前后ASPP表达的变化。5.构建iASPP的siRNA真核表达载体,利用脂质体法将iASPP干扰质粒转染入2株细胞中,通过RT-PCR及Western Blot实验检测细胞株中iASPP mRNA和蛋白质表达。实验数据采用SPSS 13.0统计软件,计量资料采用±s表示,两组表达率比较采用χ2检验,两组均数比较采用t检验。结果1.制备的ASPP1,ASPP2标准品经重复实验,得出目的基因ASPP1、ASPP2的标准曲线,可以呈现良好的线性关系和重复性,斜率均值分别为-3.249、-3.358,相关系数可达到0.98以上,标准曲线的扩增效率分别为1.156、1.028,结果显示标准曲线的扩增效率良好,具有良好的稳定性与重复性,并且融解曲线峰型单一,均得到较好的扩增曲线和标准曲线。2.免疫组化检测了37例肺癌组织和正常肺组织标本p53蛋白表达,肺癌组17例阴性,20例阳性,阳性率54.1%,其中腺癌为62.5%(10/16),鳞癌60.0%(9/15),p53阳性表达在腺癌与鳞癌间无显著性差异(P>0.05);正常肺组织35例阴性,2例阳性,阳性率5.7%。肺癌组p53蛋白表达率明显高于对照组,差异有显著意义(χ2=9.65,P﹤0.01)。肺癌组织、癌旁组织、肺组织的ASPP1,ASPP2 mRNA表达均逐渐升高,有统计学意义,肺癌组的ASPP1,ASPP2 mRNA的表达分别为:(4.27±0.57)×10~3,(2.34±0.75)×10~3,明显低于癌旁组织和肺组织。肺癌组织中ASPP1,ASPP2 mRNA表达在p53阴性组中明显低于p53阳性组,癌旁组织和正常肺组织的ASPP1,ASPP2 mRNA的表达两组无显著性差异。3.顺铂作用NCI-H157和A549细胞后,检测ASPP1、ASPP2和iASPP mRNA的表达量变化。NCI-H157和A549细胞的ASPP1、ASPP2 mRNA的表达存在差异(P<0.05),NCI-H157细胞株中ASPP1, ASPP2 mRNA的表达量明显高于A549细胞(P均<0.05)。顺铂处理24小时后,A549细胞ASPP1 mRNA无显著性差异(P>0.05),ASPP2 mRNA表达量明显升高(P<0.05)。但ASPP1、ASPP2 mRNA在NCI-H157细胞株中的表达均明显升高(P均<0.05)。应用RT-PCR检测iASPP mRNA表达量,A549细胞中的表达明显高于NCI-H157细胞(P<0.05),顺铂处理后,iASPP mRNA表达量在A549中无显著变化(P>0.05),而在NCI-H157细胞中表达量明显降低(P<0.05)。4.非小细胞肺癌组外周血中ASPP1,ASPP2 mRNA的表达分别为:(2.49±0.32)×10~3,(7.00±1.17)×10~3,明显低于对照组:(1.46±0.31)×10~4,(1.20±0.18)×10~4(P均<0.05)。肺癌组术后化疗前ASPP1、ASPP2 mRNA值分别为(2.34±0.56)×10~3、(6.64±0.72)×10~3,进行两个周期化疗后测定结果分别为(3.66±0.64)×10~3、(9.42±0.44)×10~3,基因表达量均明显升高(P均<0.05)。5.两组iASPP干扰质粒均可使两株细胞iASPPmRNA及蛋白表达下降,其中iASPP-si1对A549的mRNA和蛋白抑制率分别为58.3%、46.8%,对NCI-H157的mRNA和蛋白抑制率分别为41.3%、34.4% ;iASPP-si2对A549的mRNA和蛋白抑制率分别为53.9%、46.8%,对NCI-H157的mRNA和蛋白抑制率分别为45.8%、34.2%。结论1.目的基因ASPP1和ASPP2通过Real-time PCR检测具有良好的稳定性与重复性,标准品构建成功,可用于检测人ASPP1和ASPP2基因的表达。2.肺癌组织的ASPP1、ASPP2 mRNA表达降低与非小细胞肺癌的发生密切相关。肺癌组织中ASPP1、ASPP2 mRNA表达在p53阴性组中明显低于p53阳性组,提示表达野生型p53的非小细胞肺癌发生可能与ASPP1,ASPP2 mRNA表达降低有关。3.非小细胞肺癌突变型细胞株(NCI-H157)ASPP1、ASPP2 mRNA的表达均高于野生型细胞株(A549),而iASPP在野生型细胞中表达高于突变型细胞株,提示导致具有野生型p53基因的肿瘤细胞凋亡缺陷可能与ASPP家族对p53促凋亡功能降低有关。4.在非小细胞肺癌患者化疗过程中,ASPP1和ASPP2 mRNA的表达与化疗药物的敏感性密切相关。ASPP家族有望成为非小细胞肺癌基因治疗的分子靶点,为诊断及治疗的判断提供新的指标。5.siRNA干扰质粒转染入NSCLC细胞株A549和NCI-H157,可以使iASPP mRNA转录后降解,进而引起功能性iASPP蛋白表达下调。