论文部分内容阅读
第一部分MCP-1/CCR2增强脊髓NMDA受体活性参与大鼠骨癌痛目的骨癌痛是临床上遇见的难治性疼痛,严重影响患者生活质量,其发生机制尚不清楚。研究表明单核细胞趋化蛋白(MCP-1)及其受体(CCR2)在骨癌痛中机制现在还不是很清楚。本研究的目旨在探讨MCP-1/CCR2在骨癌痛中的作用机制。方法健康雌性SD大鼠共232只,其中180只利用纤毛机械刺激针方法用于行为学试验,采用随机数字表法分为以下18组(n=10):假手术组(Sham组)、骨癌痛组(CIBP组)、假手术+磷酸盐缓冲液(PBS)溶剂组(Sham+PBS组)、骨癌痛+PBS组(CIBP+PBS组)、假手术+MCP-1中和抗体MCP-1Ab组(Sham+MCP-1Ab组)、骨癌痛+MCP-1Ab组(CIBP+MCP-1Ab组)、假手术+二甲亚砜(DMSO)溶剂组(Sham+DMSO组)、骨癌痛+DMSO组(CIBP+DMSO组)、假手术+CCR2抑制剂RS102895组(Sham+RS102895组)、骨癌痛+RS102895组(CIBP+RS102895组)、假手术+(DMSO)组(Sham+DMSO组)、骨癌痛+DMSO组(CIBP+DMSO组)、假手术+N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抑制剂MK801组(Sham+MK801组)、骨癌痛+MK801组(CIBP+MK801组)、假手术+DMSO+PBS(Sham+DMSO+PBS组)、骨癌痛+DMSO+PBS组(CIBP+DMSO+PBS组)、骨癌痛+DMSO+MCP-1组(CIBP+DMSO+MCP-1组)、骨癌痛+MK801+MCP-1组(CIBP+MK801+MCP-1组)。另外48只SD大鼠采用随机数字表法分为以下12组(n=4):假手术组(Sham组)、骨癌痛5d组(CIBP 5d组)、骨癌痛9d组(CIBP9d组)、骨癌痛14d组(CIBP 14d组)、骨癌痛+PBS组(CIBP+PBS组)、骨癌痛+MCP-1Ab后1h组(CIBP+MCP-1Ab 1h组)、骨癌痛+MCP-1Ab后2h组(CIBP+MCP-1Ab 2h组)、骨癌痛+MCP-1Ab后12h组(CIBP+MCP-1Ab 12h组)、骨癌痛+DMSO组(CIBP+DMSO组)、骨癌痛+RS102895后2h组(CIBP+RS1028952h组)、骨癌痛+RS102895后4h组(CIBP+RS102895 4h组)、骨癌痛+RS102895后12h组(CIBP+RS102895 12h组),通过蛋白质印迹法(Western Blot)检测大鼠脊髓MCP-1、CCR2、磷酸化的NR1(p-NR1)、NR1、磷酸化的NR2B(p-NR2B)和NR2B的表达水平。剩余4只CIBP组用于免疫荧光法检测CCR2和NMDA受体亚基在脊髓背角的定位。结果与Sham组比较,骨癌痛大鼠痛阈降低,脊髓MCP-1、CCR2、p-NR1和p-NR2B时间依赖性表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);造模后第9d鞘内注射MCP-1Ab后,与CIBP+PBS组比较,CIBP+MCP-1Ab组大鼠痛阈升高,CIBP+MCP-1Ab 1h、2h、12h组p-NR1,p-NR2B表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05);造模后第9d鞘内注射RS102895后,与CIBP+DMSO组比较,CIBP+RS102895组大鼠痛阈升高,痛觉过敏得到缓解,差异有统计学意义(P<0.05),CIBP+RS102895 2h、4h、12h组p-NR1,p-NR2B表达下调,差异有统计学意义(P<0.01);造模后第9d加入MK801后第2-10h,与CIBP+DMSO组比较,CIBP+MK801组大鼠痛阈升高,差异有统计学意义(P<0.05);造模后第9d骨癌痛大鼠鞘内注射MK801后,再鞘内注射MCP-1蛋白,与CIBP+DMSO+PBS比较,CIBP+DMSO+MCP-1组大鼠痛阈降低,与CIBP+DMSO+MCP-1组比较,CIBP+MK801+MCP-1组大鼠痛阈并不继续下调,差异均有统计学意义(P<0.01);免疫荧光结果显示造模侧CCR2、p-NR1表达明显多于对照组侧,CCR2、p-NR1与脊髓背角神经元共表达。结论在骨癌痛大鼠脊髓背角神经元,MCP-1/CCR2可诱导NMDA受体的亚基NR1和NR2B发生磷酸化,参与骨癌痛大鼠痛觉敏化。第二部分骨癌痛大鼠脊髓CCR2与P38MAPK信号通路的关系目的探讨骨癌痛大鼠脊髓趋化因子受体2(CCR2)与P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)信号通路的关系,进一步明确骨癌痛的发生机制。方法健康雌性SD大鼠共92只,其中60只利用纤毛机械刺激针方法用于行为学试验,采用随机数字表法分为以下6组(n=10):假手术组(S组)、骨癌痛组(B组)、假手术+二甲亚砜(DMSO)溶剂组(SD组)、骨癌痛+DMSO组(BD组)、假手术+RS102895 CCR2抑制剂组(SR组)、骨癌痛+RS102895 CCR2抑制剂组(BR组)。另外32只SD大鼠采用随机数字表法分为以下8组(n=4):假手术组(S组)、骨癌痛5d组(B5组)、骨癌痛9d组(B9组)、骨癌痛14d组(B14组)、骨癌痛+DMSO溶剂组(BD组)、骨癌痛+RS102895 CCR2抑制剂后0.5h组(BR0.5h组)、骨癌痛+RS102895 CCR2抑制剂后4h组(BR4h组)、骨癌痛+RS102895 CCR2抑制剂后12h组(BR12h组),通过蛋白质印迹法(Western Blot)检测大鼠脊髓P38蛋白、磷酸化的P38(p-P38)和CCR2的表达水平。结果与S组比较,B组造模后5、7、9、14、21d时机械痛阈值降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。与SD组比较,BD组机械痛阈值降低,与BD组比较,BR组机械痛阈值升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与S组比较,B5组、B9组和B14组大鼠脊髓p-P38和CCR2表达上调,差异均有统计学意义(P<0.01)。与BD组比较,BR0.5h组、BR4h组和BR12h组大鼠脊髓p-P38表达水平明显下调,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论脊髓CCR2可能通过激活P38MAPK信号通路参与了大鼠骨癌痛痛觉过敏的发生。