研究背景脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,占所有原发性脑肿瘤的32%,其中超过一半为恶性程度最高的WHO Ⅳ级多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiform,GBM)。研究显示,约88%的GBM患者确诊后总体生存期不足1年,且5年生存率<5%。GBM患者预后不良的主要原因在于肿瘤细胞的高度增殖能力、浸润性生长、瘤内遗传异质性以及微血管增生等恶性表型及特征。目前,国际上治疗GBM的标准方案为手术切除后给予替莫唑胺(Temolozomide,TMZ)同步化疗,并联合应用放射治疗,但整体治疗效果并不理想。由于胶质瘤细胞向周围脑组织的浸润特性以及血脑屏障对化疗药物通透性较差,即使利用目前先进的显微外科手术技术,仍难以将肿瘤完全切除,且易导致胶质瘤细胞对治疗干预措施的高度抵抗及耐受。因此,寻找有效抑制胶质瘤恶性生物学特性的新型治疗方式,从而延长患者生存期、提高患者生存质量,是神经肿瘤治疗领域面临的重要挑战。近年来,随着分子生物学技术及肿瘤遗传学研究的不断发展,对胶质瘤发病机理的认识也不断深入。既往的世界卫生组织(World Health Organization,WHO)胶质瘤病理分级标准中,以显微镜下肿瘤的细胞形态学特征为重点进行分级判断。然而不断有研究表明,组织特征相似的胶质瘤基因表型特征却存在不同,伴随着个体间生存期的较大异质性。2016年WHO依据基因表型特征对中枢神经系统肿瘤分型进行更新,首次将多个分子病理学指标(包括IDH1突变、MGMT启动子区甲基化、染色体1p/19q的共缺失,TERT及ATRX基因突变等)纳入分类标准。同时,基于TCGA基因聚类分析的分子亚型分类标准将胶质瘤分为四类亚型:前神经元型(Proneural)、经典型(Classical)、神经元型(Neural)及间充质型(Mesenchymal),其中,间充质型胶质瘤相比前神经元型胶质瘤具有较大异质性的基因组表达特征,其恶性度及浸润性高,预后较差;而前神经元型胶质瘤往往伴随较长生存期。因此,探寻间充质型胶质瘤特异性表达分子及其调控机制,亦有望深入阐释胶质瘤恶性进展的潜在机理。新近研究表明,胶质瘤中发生的上皮-间充质转化过程(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是揭示其获得高侵袭、迁移特性的重要机制,也是促进其恶性生物学进展的关键驱动环节。在EMT过程中,上皮样(Epithelial phenotype)细胞发生了多种生物学变化向间充质样(Mesenchymalphenotype)细胞转变,这其中包括细胞间黏连减弱以及细胞形态的改变,并伴随着肿瘤细胞运动能力增强、化疗耐受及失巢凋亡等现象。在EMT过程中,最为经典的分子指标改变为膜表面钙粘着蛋白N-cadherin的升高及E-cadherin的下降。同时,研究已发现在高级别及预后较差的胶质瘤患者组织中,EMT过程关键调控因子及多个间充质型标志物表达呈异常上调状态。对EMT过程及间充质型胶质瘤相关分子机制的不断深入研究发现,细胞中的多类分子与肿瘤侵袭、EMT存在密切关联,已有多项研究表明细胞骨架相关蛋白家族及RAB家族在肿瘤侵袭、转移中发挥重要调控作用。在本课题中,通过前期检测 TCGA(The Cancer Genome Atlas)及 GEO(Gene Expression Omnibus)胶质瘤基因组数据库信息,我们首次发现:细胞骨架结合蛋白TAGLN2以及RAB43在高级别胶质瘤及间充质亚型肿瘤组织中的mRNA水平明显上调。因此,本课题拟深入探讨TAGLN2及RAB43分子在胶质瘤中的表达及临床意义,并研究其对胶质瘤恶性表型及EMT过程的调控作用,以评估TAGLN2及RAB43分子作为新的肿瘤标志物及分子靶点在临床中的转化应用前景。TAGLN2(Transgelin-2)是一类Actin细胞骨架结合蛋白家族的重要成员,又称为Actin交联蛋白。TAGLN家族由3个亚型组成,包括TAGLN1(又称为SM22α),TAGLN2和TAGLN3。该分子家族在正常组织细胞中表达广泛,结构中包含共同的钙调蛋白同源结构域(Calponinhomologdomain,CHdomain),并存在多个钙离子及磷酸化修饰结合位点。最初有文献报道TAGLN蛋白定位于细胞胞浆,广泛表达于平滑肌细胞及成纤维细胞,并通过直接结合Actin肌动蛋白微丝结构影响细胞骨架的重塑,进而参与细胞形态转化、细胞迁移运动、细胞分化及增殖凋亡等功能调控。由于TAGLN蛋白家族在细胞骨架重塑及细胞形态转化中的作用,其在肿瘤细胞恶性表型中的潜在功能受到研究者关注。同时,新近有文献报道TAGLN家族不仅与Actin骨架紧密连接调控细胞运动,其在细胞核中亦有表达,并可能通过直接调控相关基因的表达而影响细胞表型,因此,TAGLN家族在各类肿瘤中的调控作用有待深入阐明。TAGLN2是TAGLN家族的重要成员,分子量为24kDa,其与TAGLN1含有64%的同源氨基酸结构,并与细胞内肌动蛋白微丝结构紧密结合发挥作用。与TAGLN1分布特点不同,TAGLN2主要分布于上皮细胞,在动静脉平滑肌细胞中亦有表达。目前,TAGLN2在肿瘤中的作用尚未明确,例如,在乳腺癌中的研究显示TAGLN2在侵袭性肿瘤细胞中表达下调;但在膀胱癌及宫颈癌中发挥癌基因效应,促进其侵袭能力。而对于胶质瘤中TAGLN2的表达特征与临床意义,以及TAGLN2是否参与调节胶质瘤侵袭相关恶性表型目前尚无相关报道。RAB43(Ras-relatedGTP-bindingprotein43)蛋白是 RAS 蛋白超家族中的一员,其分子量为23 kDa。RAB43主要定位于细胞内质网及高尔基体,在生理状态下广泛参与介导囊泡运动、信号转导及蛋白运输过程。新近的多项研究已发现,RAB蛋白家族中的多个成员不仅参与了细胞内各组分的囊泡形成、运输环节,在肿瘤进程中亦扮演了重要角色。在乳腺癌和卵巢癌中的研究发现RAB25可与肿瘤细胞中的整合素再循环囊泡直接结合,进而参与细胞向细胞外基质的侵袭。另有研究发现,RAB3D蛋白在侵袭性结肠癌组织中的表达显著升高,并通过介导EMT过程在结肠癌细胞的侵袭及转移中发挥关键作用。此外,在包括胶质瘤在内的多类恶性肿瘤中发现RAB27A、RAB38蛋白与患者临床病理学指标及恶性表型标志物存在相关性。而作为参与蛋白转运及高尔基体结构的重要分子,RAB43在胶质瘤中的作用目前尚无文献报道,有待深入探讨。基于前期研究现状,本课题结合数据库差异性表达分析结果,以细胞骨架结合蛋白TAGLN2以及RAB43为研究重点,揭示其在胶质瘤中的表达特征及临床预后意义。利用生物学信息学GO(GeneOntology)及KEGG(Kyotoencyclopedia of genes and genomes)富集分析,我们首先预测了与TAGLN2及RAB43显著相关的生物学功能及信号通路;随后,通过Western blot及功能学实验,从分子、细胞水平分别检测了 TAGLN2及RAB43蛋白对胶质瘤细胞侵袭、运动能力及其他恶性表型的影响,同时探究其与上皮-间充质转化(EMT)过程的密切关系,阐明其在胶质瘤恶性行为中的作用机制,从而为胶质瘤的临床治疗提供新的靶点及理论基础。第一部分细胞骨架结合蛋白TAGLN2在胶质瘤恶性生物学行为中的作用机制及临床意义目的探究TAGLN2分子在不同级别胶质瘤中的表达水平及预后意义,明确其在间充质亚型中的特征性表达,评估TAGLN2与患者分子病理学特征的统计学关联,探究TAGLN2是否影响EMT过程及其调控胶质瘤相关恶性表型的作用机制,并初步检测胶质瘤中TGFβ是否作为上游信号通路参与TAGLN2的表达调控。方法本实验通过免疫组化技术检测46例(WHO II-IV级)胶质瘤样本及5例因外伤或脑疝切除的脑组织中的TAGLN2表达含量;利用公共平台TCGA、GEO等基因芯片Microarray数据库,绘制TAGLN2的表达特征图谱及生存曲线,评估该分子在不同级别及各亚型肿瘤中的表达差异及临床意义;基于生物信息学平台预测TAGLN2在胶质瘤中的潜在生物学功能及密切相关的信号通路,利用RNA干扰技术结合功能学实验(3D微球体侵袭模型、CCK8、EdU荧光、流式细胞术等)检测TAGLN2对胶质瘤侵袭、增殖、细胞周期及凋亡过程的影响,并利用Western Blot检测EMT相关分子及信号通路变化;构建原位荷瘤小鼠模型研究靶向沉默TAGLN2对体内成瘤的影响。结果1.TAGLN2表达水平与胶质瘤恶性程度正相关,并高表达于间充质型(Mesenchymal subtype)胶质瘤样本免疫组化结果及数据库生物信息学结果显示:GBM患者肿瘤样本中的TAGLN2表达水平显著高于低级别胶质瘤LGGs及正常脑组织,并于间充质亚型胶质瘤中上调。同时,TAGLN2高表达于IDH1野生型样本,而低表达于MGMT甲基化、染色体1p/19q共缺失、TERT缺失以及ATRX突变胶质瘤样本。提示TAGLN2可作为一项新的分子标志物用于评估胶质瘤患者恶性程度,并为胶质瘤临床诊断提供新的思路及参考。2.TAGLN2高表达与胶质瘤患者不良预后相关生存曲线及Log-rank检验显示,TAGLN2高表达组分别在低级别胶质瘤及GBM中与患者不良预后密切相关。进一步,多因素Cox回归分析表明:TAGLN2可作为一项独立不良预后指标(HR =1.713,95%CI= 1.384-2.119,P<0.001)用于评估患者术后生存状况。3.生物信息学预测TAGLN2在胶质瘤中的潜在生物学功能及信号通路调控GO功能分析发现TAGLN2与多类生物学功能紧密相关,包括信号转导、细胞存活、细胞侵袭、细胞外基质重构、细胞粘附及周期调控。KEGGpathway分析显示TAGLN2富集于多条肿瘤相关信号通路,包括细胞骨架调控、粘附分子相关通路等。GSEA分析进一步验证TAGLN2与上皮-间充质转换、肿瘤转移以及G1-S期细胞周期转化过程密切相关。4.敲除TAGLN2抑制胶质瘤细胞侵袭能力及间充质特性利用3D球状体基质胶侵袭模型检测TAGLN2特异性敲除后胶质瘤细胞侵袭能力的改变。观察结果表明,与Control组相比,si-TAGLN2组胶质瘤微球在培养96h后的侵袭区域面积受到显著抑制。敲除TAGLN2蛋白后,U87MG及U251的间充质表型指标N-cadherin、β-catenin及EMT关键转录因子Snail、Slug、Twist蛋白的表达量明显下调。同时,si-TAGLN2组细胞侵袭伪足(Invadopodia)含量明显降低,因此,TAGLN2可能通过参与胶质瘤EMT过程及侵袭伪足的形成进而调控细胞侵袭能力。5.TAGLN2对胶质瘤细胞周期及细胞凋亡功能的影响敲除TAGLN2蛋白后,CCK-8细胞生长曲线受到显著抑制,EdU阳性细胞率亦发生明显降低。进一步利用流式细胞术显示敲除TAGLN2导致周期阻滞于G0/G1期。转录因子FoxM1在TAGLN2敲除后表达量降低,同时,周期调控因子CDK2、CyclinB1等亦发生明显降低,周期抑制因子p21、p27蛋白显著上调,并伴随p21下游分子c-Myc及Survivin表达量下降。另一方面,细胞晚期凋亡率随TAGLN2的敲除而明显升高。6.TGFβ信号通路参与调控TAGLN2的表达首先,应用数据库平台明确TGFβ2在GBM中的表达明显高于LGGs;且患者共表达两分子(TAGLN2higTGFβ2high)时,预后明显较差;关联性分析显示胶质瘤中TAGLN2与TGFβ2分子存在显著线性相关。体外给予TGFβ2(0,1,5,10 ng/mL)刺激后TAGLN2及N-cadherin表达水平上调,而使用TGFβ受体特异性抑制剂SB431542时,TGFβ2诱导的TAGLN2及N-cadherin表达上调受到显著抑制,以上结果提示TGFβ2信号通路参与调控了胶质瘤中TAGLN2的表达。7.体内实验证实敲除TAGLN2可延长原位荷瘤小鼠生存期裸鼠随机分选为Control组及sh-TAGLN2组(n=5),将慢病毒稳转细胞(约1×106)定向注射裸鼠颅内,构建原位种瘤模型。脑切片HE染色结果显示sh-TAGLN2组裸鼠颅内肿瘤明显缩小,同时生存期明显长于Control组(44.0vs28.5天,P<0.05)。免疫组化证实,sh-TAGLN2组颅内肿瘤TAGLN2表达量明显较低,同时,EMT标志物N-cadherin及增殖标志物Ki-67表达量亦受到明显抑制。结论在本研究部分我们首次发现TAGLN2基因表达水平与胶质瘤恶性程度正相关,并高表达于间充质型(Mesenchymalsubtype)及预后不良胶质瘤患者。功能学实验提示TAGLN2参与了胶质瘤生长、侵袭、EMT转化等功能。因此,TAGLN2可能作为胶质瘤新的生物学标记物及潜在治疗靶点,而对于该分子对FoxM1相关通路的具体调控机制及其在TGFβ2信号中的重要作用,有待后续研究进一步探讨。第二部分RAB43蛋白在胶质瘤侵袭及上皮-间充质转化中的作用机制及临床意义目的分析RAB43分子在不同恶性程度胶质瘤中的差异性表达,统计RAB43与胶质瘤分子病理学指标的相关性并评估RAB43与胶质瘤患者术后生存期的关联,检测特异性敲除RAB43对胶质瘤生物学功能的影响,探究RAB43是否调控肿瘤侵袭及EMT过程。方法本实验利用免疫组化手段检测52例(WHO grades II-IV)胶质瘤样本及5例正常脑组织中的RAB43差异性表达;利用公共数据平台Microoarray数据库,分析RAB43的表达特征及生存曲线,评估该分子在间充质亚型中的特异性表达及临床患者预后意义;基于生物信息学平台预测RAB43在胶质瘤中的潜在生物学功能及密切相关的信号通路;利用Transwell检测RAB43对胶质瘤侵袭、迁移能力影响,并通过Western Blot评估EMT相关分子变化。结果1.RAB43表达水平与胶质瘤级别进展相关免疫组化结果及数据库生物信息学结果显示:高级别患者胶质瘤样本中的RAB43水平显著高于低级别及正常组织,而在低级别与正常组织之间未发现RAB43表达差异性。相关性分析结果显示RAB43高表达组与胶质瘤WHO分级(P<0.0001)、年龄≥45岁(P = 0.0056)呈正相关,但与患者性别(P=0.4151)及治疗前卡氏评分(P = 0.0675)并无相关性。2.RAB43高表达预示胶质瘤患者不良预后生存曲线及Log-rank检验显示,高表达RAB43基因患者相对于低表达RAB43组其总体生存期明显较短。利用TCGA数据库提取348例GBM患者信息亦发现RAB43表达量具有明确的预后指示,并于Rembrandt(n = 329)及GSE16011(n= 284)数据库中分别在低级别及高级别胶质瘤中验证了 RAB43的预后意义。3.RAB43高表达于间充质亚型胶质瘤并与多类分子病理特征相关RAB43分子在间充质型胶质瘤样本中的表达量明显高于前神经元型及其他分型,同时高表达于恶性程度较高的G3型胶质瘤,而在G1、G2分型中处于低表达状态。进一步对胶质瘤其他分子病理学指标的表达量分析提示RAB43分子高表达于IDH1野生型样本,而低表达于MGMT甲基化、染色体1p/19q共缺失胶质瘤样本,进一步提示RAB43可能作为一类癌基因在胶质瘤中发挥作用。4.生物信息学提示RAB43富集于胶质瘤侵袭及粘附相关功能GO功能分析提示RAB43高度富集于免疫应激反应、细胞粘附、细胞侵袭、胞外基质重构等功能。同时,KEGG通路分析亦发现RAB43正相关分子与肿瘤侵袭相关信号如细胞粘附分子、ECM受体相互作用相关。在关联性分析中MMP-2、MMP-9、IL-6、IL-8、VEGFA以及Ki-67等肿瘤相关标志物均与其存在统计学关联。5.RAB43参与调控胶质瘤细胞侵袭能力及间充质特性Transwell实验结果表明,siRAB43组胶质瘤细胞迁移及侵袭穿过基质胶的数明显降低。进一步Western结果显示敲除RAB43后间充质相关指标N-cadherin、Vimentin、Snail表达水平明显下调。因此,RAB43可能通过参与胶质瘤EMT过程进而调控细胞侵袭能力。结论在本研究部分,我们首次发现RAB43表达水平与胶质瘤级别进展相关,其高表达与间充质亚型及其他恶性病理学指标密切相关,并预示患者不良预后。功能学实验发现敲除RAB43显著抑制胶质瘤侵袭、EMT转化过程,因此,RAB43可能在胶质瘤病理进展中扮演重要角色,并可作为新的预后评估指标及分子干预靶点应用于胶质瘤患者临床诊疗。