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目的:糖尿病角膜病变是糖尿病的一种常见并发症,可导致糖尿病患者视功能严重减退。糖基化终末产物(AGEs)的累积在糖尿病角膜病变中发挥重要作用。既往研究认为,AGEs可与糖基化终末产物受体(RAGE)结合,启动细胞活性氧(ROS)生成、炎症反应、凋亡,从而促进糖尿病角膜病变的发生发展。近来研究发现,AGEs的另一受体——糖基化终末产物受体-1(AGER1)在糖尿病患者中受到抑制,提示其可能参与糖尿病及并发症的发生发展,但其在糖尿病角膜病变中是否具有作用及相关机制目前尚无研究。因此,本课题拟以人角膜上皮细胞(HCEC)及链脲佐菌素(STZ)诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠为实验模型,通过体内外的功能研究探讨AGER1在AGEs介导的糖尿病角膜病变中的作用及机制。方法:1.通过免疫组化、免疫荧光、实时定量PCR(RT-PCR)及Western blot(WB)等方法检测糖尿病患者、I型(STZ小鼠、INS2Akita+小鼠)、Ⅱ型(BKS-db/db)糖尿病小鼠角膜中AGEs及AGER1相关通路基因的表达情况,观察AGER1是否参与糖尿病角膜病变过程。2.以HCEC为体外细胞模型,外源加入AGEs-BSA、AGER1干扰RNA及AGER1过表达质粒后,分别以MTT法检测细胞增殖能力变化、划痕法检测细胞迁移能力变化、AV/PI法检测凋亡水平变化、DCFH-DA法检ROS水平变化、RT-PCR及WB检测AGER1、依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶(Sirt1)、RAGE等相关通路基因的表达变化,探讨AGER1在AGEs介导的糖尿病角膜病变中的具体作用及机制。3.以C57BL/6J小鼠为动物模型,结膜下注射AGEs-BSA,通过小鼠上皮刮除实验研究AGEs对小鼠角膜上皮刮除后愈合的影响,通过免疫荧光、RT-PCR检测结膜下注射AGEs-BSA对AGER1、Sirt1、RAGE等相关通路基因表达的影响;以STZ小鼠为糖尿病模型,通过慢病毒转染对角膜组织行AGER1 过表达,RT-PCR 检测 AGER1 过表达后对 AGER1、Sirt1、RAGE等相关通路基因表达的影响,探讨AGER1过表达对糖尿病小鼠角膜的作用及分子作用机制。结果:1.与对照相比,糖尿病患者及STZ、INS2Akta/+、BKS-db/db小鼠角膜组织中都有相对较多的AGEs的积累且主要位于上皮下基底膜,并都表现出AGER1受体表达显著减少;STZ及INS2Akita/+、BKS-db/db小鼠角膜组织中RAGE受体表达显著增多;STZ及INS2Akita/+小鼠角膜组织Sirtl表达显著减少;STZ小鼠全角膜组织乙酰化的核转录因子-kB(Acl-NF-kB)表达显著升高、促炎的肿瘤坏死因子(TNF-α)(P<0.01)表达显著升高、抗凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)(P<0.01)表达显著减少;STZ小鼠角膜上皮促炎因子TNF-α(P<0.01)、白介素-1(IL-1)(P<0.05)及白介素-6(IL-6)(P<0.01)表达都显著升高;BKS-db/db小鼠全角膜促炎因子IL-6表达显著升高。2.AGEs-BSA处理HCEC后,细胞增殖能力(P<0.05)、迁移能力(P<0.05)都显著降低,ROS生成增多,AGER1受体及Sirt1表达显著减少,而RAGE及Acl-NF-kB表达则显著增加。通过干扰RNA对AGER1干扰后,HCEC增殖能力显著降低(P<0.01),ROS生成增多,凋亡增多;分子检测发现AGER1干扰使Sirtl蛋白表达量降低,RAGE受体、Acl-NF-kB表达量升高,促炎因子IL-1(P<0.01)与促凋亡因子Bcl-2相关X蛋白(Bax)(P<0.05)显著升高。AGER1过表达后RAGE(P＜0.01)、Acl-NF-kB表达受到显著抑制,而Sirtl蛋白表达变化不著,促炎与促凋亡因子TNF-α、IL-1、IL-6、Bax表达均显著降低(P均<0.01)。3.STZ小鼠角膜上皮刮除2.5mm后24h、36h角膜上皮缺损率较C57BL/6J对照组显著升高(P均<0.05);结膜下注射AGEs-BSA后12h、24h、36h C57BL/6J小鼠角膜上皮愈合均显著延迟(P均<0.05),且在mRNA水平上AGER1(P<0.01)、Sirtl(P<0.01)、Bcl-2(P<0.01)表达显著减少,RAGE(P<0.05)、IL-1(P<0.01)、IL-6(P<0.01)、Bax(P<0.05)表达显著升高,而Acl-NF-kB蛋白表达增加。AGER1过表达使体外培养的STZ小鼠角膜组织中促炎因子TNF-α(P<0.05)及促凋亡因子Bax(P<0.01)表达显著降低。结论:1.Ⅱ型糖尿病患者及糖尿病模型小鼠角膜中均存在AGEs累积,且AGER1受体表达降低、RAGE受体表达升高。外源性AGEs可使小鼠角膜上皮修复显著延迟。2.糖尿病模型小鼠促炎症、凋亡基因表达增加,提示炎症与凋亡可能参与糖尿病角膜病变的发病机制。3.AGEs能够显著抑制HCEC的增殖、迁移,并促进HCEC细胞ROS产生,在体内、体外促进炎症、凋亡发生,在体内通过AGERl/Sirtl、RAGE/Acl-NF-kB两条受体通路发挥作用。4.AGER1干扰可使RAGE表达上升,加重AGEs对HCEC的不良影响;而AGER1过表达则使RAGE表达下降,减轻这些作用。保护性受体AGER1与损伤性受体RAGE可能存在与AGEs的竞争性结合,两受体通路有相互拮抗的作用。5.AGER1受体在糖尿病角膜病变中起保护性作用,且可能通过减轻角膜上皮细胞的炎症、凋亡等发挥作用,可成为糖尿病角膜病变防治新靶点。