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研究背景功能性消化不良（functional dyspepsia,FD）是指具有餐后饱胀、早饱、上腹痛、上腹部烧灼感等不适症状,经检查排除引起上述症状的相关器质性病变的临床综合征,是最常见的内科系统疾病之一。本病发病机制复杂,严重影响患者生活。中医治疗FD具有一定的优势,健脾理气方可针对本病脾虚气滞的核心病机发挥健脾益气、疏肝理气的功效,显示出良好的临床疗效。肠嗜铬细胞（enterochromaffin cells,ECs）被认为与功能性胃肠病（functional gastrointestinal disorders,FGIDs）中内脏高敏和胃肠动力异常的病理机制有关,但其是否与FD中黏膜机械屏障紧密连接（tightjunctions,TJs）损伤有关仍不清楚。因此,本课题拟从临床和实验研究验证健脾理气方治疗FD的疗效,并探究EC细胞与TJs损伤的关联,以期揭示FD的病理机制,并为健脾理气方的临床应用提供更多证据。第一部分临床研究健脾理气法中药治疗功能性消化不良随机对照研究的Meta分析研究目的:评价健脾理气法中药治疗FD的临床疗效,为临床治疗提供参考和依据。研究方法:检索PubMed、Embase、Cochrane Library、中国期刊全文数据库（CNKI）、中文科技期刊全文数据库（VIP）、万方数据库（WanFang Datebase）关于健脾理气法中药治疗FD的随机对照研究文献,根据Cochrane标准进行文献纳入筛选、数据提取、质量评价,采用RevMen5.3进行数据分析。研究结果:共纳入31篇文献,合计3182例患者,Meta分析结果显示健脾理气法中药治疗FD的总有效率优于对照组（OR=4.15,95%CI[3.40,5.07]）。结论和意义:健脾理气法中药治疗FD的疗效明显优于常规治疗或安慰剂,但结果仍需高质量大规模随机对照试验进一步证实。第二部分实验研究研究目的观察健脾理气方对FD大鼠胃形态结构、胃顺应性及胃敏感性的影响,以验证碘乙酰胺灌胃联合夹尾应激的FD模型,并评价健脾理气方对FD模型大鼠的胃功能的影响;检测FD大鼠十二指肠5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）和TJs的表达情况,以及健脾理气方治疗对5-HT和TJs表达的影响;观察HUTU-80细胞健脾理气方、5-HT处理前后细胞间TJs的改变,以验证健脾理气方和5-HT对TJs的影响;检测FD大鼠EC细胞表达及其合成释放5-HT功能的变化以及健脾理气方对这一改变的影响,以揭示FD的EC细胞相关病理机制及健脾理气方的作用机制。研究方法实验一:健脾理气方对功能性消化不良大鼠胃形态和功能的影响36只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、中药干预组,每组共12只,除正常组外,模型组和中药干预组采用碘乙酰胺灌胃联合夹尾应激法制备FD大鼠模型,造模结束后中药干预组予健脾理气方中药煎剂灌胃,正常组、模型组予等体积生理盐水,连续7天,期间中药干预组和模型组持续给予夹尾刺激。干预结束后,每组随机选取6只大鼠麻醉后取材,取胃组织行HE染色,另外6只进行胃顺应性和敏感性检测。实验二:健脾理气方对功能性消化不良大鼠十二指肠5-羟色胺与紧密连接的影响18只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、中药干预组,每组共6只,除正常组外,模型组和中药干预组采用碘乙酰胺灌胃联合夹尾应激法制备FD大鼠模型,造模结束后中药干预组予健脾理气方中药煎剂灌胃,正常组、模型组予等体积生理盐水,连续7天,期间中药干预组和模型组持续给予夹尾刺激。干预结束后,取大鼠十二指肠组织分别行ELISA和qPCR检测,并制备冰冻切片行免疫荧光染色。培养在12孔板中的HUTU-80细胞随机分为正常对照组、5-HT处理组、5-HT+中药血清处理组、5-HT+空白血清对照组,使用5-HT、中药含药血清、空白血清分别处理细胞,检测处理后细胞间TJs的表达情况。实验三:健脾理气方对功能性消化不良大鼠肠嗜铬细胞表达和功能的影响18只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、中药干预组,每组共6只,除正常组外,模型组和中药干预组采用碘乙酰胺灌胃联合夹尾应激法制备FD大鼠模型,造模结束后中药干预组予健脾理气方中药煎剂灌胃,正常组、模型组予等体积生理盐水,连续7天,期间中药干预组和模型组持续给予夹尾刺激。干预结束后,18只大鼠麻醉后进行取材,取十二指肠组织分别行qPCR、免疫组化、免疫荧光检测。研究结果实验一:健脾理气方对功能性消化不良大鼠胃形态和功能的影响HE染色示各组大鼠胃组织形态无明显异常。胃顺应性检测示:与正常组大鼠相比,模型组大鼠胃顺应性显著减低,经健脾理气方治疗后,大鼠胃顺应性恢复,中药干预组大鼠胃顺应性高于模型组,差异有统计学意义（P＜0.05）。胃敏感性检测示:模型组大鼠胃敏感性明显高于正常组大鼠,而中药干预组大鼠胃敏感性低于模型组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。实验二:健脾理气方对功能性消化不良大鼠十二指肠5-羟色胺与紧密连接的影响ELISA结果显示:模型组大鼠十二指肠5-HT表达对比正常组大鼠显著升高（P＜0.01）;而中药干预组大鼠十二指肠5-HT表达对比模型组大鼠减少（P＜0.05）。qPCR结果显示:模型组大鼠十二指肠TJs各组分mRNA表达量较正常组均显著减少（P＜0.01）;而经过健脾理气方治疗后,中药干预组大鼠十二指肠TJs部分恢复（P＜0.01）。免疫荧光染色显示:十二指肠TJs各蛋白组分荧光均明显减弱、断续,健脾理气方治疗后相应荧光增强,连续性亦有所改善。免疫荧光染色法检测HUTU-80细胞TJs各蛋白组分,正常对照组细胞TJs各蛋白组分荧光均清晰连贯的沿细胞膜表面分布,5-HT处理组荧光强度减弱、断续,5-HT+中药血清处理组荧光信号部分恢复,而5-HT+空白血清对照组荧光仍缺损。实验三:健脾理气方对功能性消化不良大鼠肠嗜铬细胞表达和功能的影响qPCR显示,成对盒基因4（paired box gene 4,PAX4）、色氨酸羟化酶1（tryptophan hydroxylase1,TPH1）mRNA表达在模型组显著增多,而中药干预组PAX4、TPH1 mRNA表达显著降低,差异均具有统计学意义（P＜0.01）。免疫组化显示:模型组大鼠对比正常组大鼠,其5-HT阳性着色细胞数量、PAX4、TPH1表达显著增多,染色强度增高（P＜0.01）,而中药干预组对比模型组,其5-HT阳性着色细胞数量减少（P＜0.05）,5-HT和PAX4、TPH1染色强度降低（P＜0.01）。各组TRPA1、TRPC4转录和蛋白表达水平基本一致,差异不具有统计学意义（P＞0.05）。免疫荧光染色同时检测5-HT和TPH1:模型组与正常组对比,其荧光显著增强,而中药干预组中,荧光的强度较模型组减弱。结论和意义本研究采用的碘乙酰胺灌胃联合夹尾应激的造模方法可以模拟FD内脏高敏感、胃顺应性降低的病理状态,而健脾理气方可改善FD大鼠胃顺应性和敏感性;FD大鼠十二指肠同时存在5-HT表达的异常增多和TJs的缺损,而5-HT可以引起HUTU-80细胞间TJs缺损;健脾理气方能够恢复十二指肠TJs,下调5-HT表达水平,并改善5-HT引起的HUTU-80细胞间TJs缺损;FD大鼠十二指肠中PAX4、TPH1表达上升,EC细胞数量异常增多,5-HT合成活跃;而健脾理气方可以降低PAX4和TPH1水平,减少EC细胞的表达和其对5-HT的分泌。