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第一部分造血干细胞在应激压力下线粒体网络结构发生了永久性重塑目的:为了明确造血干细胞发生应激后,HSC中线粒体的功能、结构和形态发生了怎样的改变,本部分研究以骨髓细胞移植作为主要的应激压力模型,检测移植后造血干细胞中线粒体网络的功能、形态结构的重塑变化。方法:取健康成年C57BL/6小鼠或mito-dendra2线粒体荧光标记转基因小鼠作为骨髓细胞移植的供者,BoyJ小鼠作为骨髓细胞移植的受者。取出供者全骨髓细胞与来自BoyJ小鼠的全骨髓细胞按照一定比例（106:106）混合后移植到致死性照射的BoyJ受体小鼠体内,构建HSC移植后模型。以HSC作为细胞主要研究对象进行后续实验及研究,移植4个月后流式细胞仪检测HSC活性线粒体数量Mitotracker-Green、线粒体膜电位TMRE和线粒体氧化应激水平Mito-Sox,ELISA检测线粒体ATP产生水平。体外分别予以移植后HSC线粒体ATP酶抑制剂和电子传递链复合物抑制剂后,用流式细胞仪检测体外处理后的线粒体膜电位变化。免疫荧光检测和观察移植后HSCs线粒体的结构形态及其与细胞间的相互关系,透射电子显微镜下观察HSCs线粒体移植前后结构形态改变的显微影像。免疫荧光检测移植对线粒体结构重塑的持续性影响。激光共聚焦显微成象系统动态观察记录移植对线粒体网络的重塑改变对HSCs子细胞的影响。结果:移植4个月后,流式细胞术检测受者BoyJ小鼠体内线粒体功能改变最显著的骨髓细胞群LSK-SLAM（HSC）(PHSC<0.05),以HSC作为细胞主要研究对象进行后续实验及研究。与未经过移植的对照组相比,移植后（1）活化线粒体数量Mito-trackergreen及线粒体膜电位MMP水平明显下降(PMito-G<0.01,PMMP<0.01)。（2）体外予以线粒体ATP酶抑制剂和电子传递链复合物抑制剂干预处理后,线粒体反应能力下降（MMP）(POligomycin<0.05,PRotenone<0.05)。（3）免疫荧光检测发现Mito-Dendra2小鼠线粒体结构更紧缩,分布向一侧聚集、偏移（P<0.0001）,每个细胞内线粒体表面数量明显减少（P=0.0093）,且每个表面所占体积相应增加（P=0.0056）,线粒体极性水平也明显增高（P=0.0014）。（4）透射电子显微镜下所见,线粒体在细胞中所占面积明显升高（P<0.0001）,线粒体的圆性程度明显降低（P<0.0001）。（5）经过多次增殖分化,移植组HSC线粒体更倾向聚集于细胞的一侧,结构也变得更为紧缩（P<0.0001）。（6）HSCs分裂后形成的子细胞中,移植组线粒体发生了不对称分裂,表现为子代细胞之间相比,表面数量比值和每表面体积比例差异明显（P<0.0001）,子代细胞间线粒体免疫荧光强度比值（P=0.04）及线粒体所占面积比值差异（P=0.005）也具有统计学差异。结论:本部分研究发现,骨髓移植后造血干细胞处于应激压力状态,导致线粒体部分功能出现缺陷,HSCs中线粒体的结构形态和分布也发生了重塑,并且这种改变不能经过细胞周期的重复得到逆转。第二部分Drp1蛋白缺失引起线粒体结构功能障碍从而导致造血干细胞子代功能下降的可能机制目的:探讨Drp1蛋白在线粒体维持正常结构形态和功能中的作用以及应激后线粒体结构和功能发生永久性重塑的可能机制,明确Drp1蛋白是否为引起线粒体结构功能障碍导致造血干细胞生物学行为改变的关键因素。方法:流式细胞仪检测移植前后造血干细胞中Drp1的荧光强度。将Drp1flox/flox转基因小鼠与干扰素诱导的Mx Cre工具小鼠杂交后,获得Drp1flox/flox:Mx Cre特异性基因敲除小鼠,构建Drp1Δ/Δ条件性基因敲除小鼠模型,同时Drp1flox/flox作为对照组。Imaris显像软件重建线粒体及Drp1蛋白三维结构立体图了解Drp1表达水平及其与线粒体结构的关系。免疫荧光检测两组之间Drp1蛋白荧光水平的表达差异,观察两组间线粒体含量及形态结构差异。激光共聚焦显微成象系统实时动态观察记录Drp1Δ/Δ对线粒体网络的重塑及活性改变对HSC下一代子细胞的影响。对Drp1Δ/Δ条件性基因敲除小鼠进行连续骨髓细胞移植后分析供者来源外周血细胞占有比例,流式细胞检测连续移植后,Drp1flox/flox与Drp1Δ/Δ组的HSCs线粒体膜电位差异。体外用mdivi-1对mito-Dendra2小鼠的HSCs进行培养处理后荧光显微镜下观察细胞线粒体形态结构及分布改变。体外用mdivi-1培养处理C57BL/6小鼠HSCs,然后进行骨髓细胞移植,流式细胞术检测Drp1蛋白缺失（基因敲除小鼠模型组及体外处理模型组）对骨髓原始细胞群、成熟细胞系分化及外周血细胞生成的影响。用5-FU对野生型C57BL/6小鼠进行应激处理,然后分别予以体内注射mdivi-1或DMSO11天和14天后分别对小鼠骨髓细胞进行分析,同时进行再移植后,用流式细胞术分析两组间供者体内外周血细胞占比差异。结果:成功构建Drp1Δ/Δ条件性基因敲除小鼠模型后,与Drp1flox/flox对照组相比,（1）Drp1Δ/Δ组线粒体Drp1蛋白水平明显下降（P=0.0057）,附着于线粒体顶端和附近的、与线粒体结合的Drp1数量也明显减少（P=0.0006,P=0.006）,同时被Drp1分隔的线粒体数量移植后明显减少（图9D,P<0.0001）。（2）免疫荧光下观察到Drp1△/△组线粒体结构更紧缩、分布更向一侧聚集、偏移,含紧缩线粒体的细胞数量明显高于对照组（P<0.0001）。（3）激光共聚焦显微成象系统下实时动态观察发现,HSC激活进入细胞间期后,Drp1△/△组线粒体动态活性明显低于Drp1fl/fl对照组（P<0.002）。在HSCs发生自我复制和细胞分裂的过程中,Drp1△/△组线粒体随着子代细胞的生成,也发生了不对称分配,子细胞间线粒体荧光强度有显著差异（P=0.0084）,但线粒体所占面积在本次分析的子细胞之间差异并不具有统计学意义（P=0.19）。（4）流式细胞学检测两组小鼠骨髓原始细胞,包括LSK-SLAM,MPP和CP的细胞数,Drp1△/△组反而高于对照组（n=6,HSC,P<0.05;MPP,P<0.05）,而在骨髓成熟细胞系和外周成熟血细胞的比较中未体现出显著的统计学差异。（5）Drp1Δ/Δ组在第一次骨髓移植后,流式细胞术检测到受者外周血中供者来源的细胞占比明显低于对照组（8K:P=0.1;16K:P<0.001）;在连续第二次移植后,Drp1Δ/Δ组HSCs重组再生能力仍明显低于对照组（P<0.05）;流式细胞术检测发现,Drp1Δ/Δ组移植后线粒体膜电位水平明显降低。（6）mdivi-1组线粒体变得更聚集融合,结构变得更为紧缩,同时线粒体还发生了重分布,显示出更强的极性。通过Imaris图像分析软件发现,mdivi-1处理组每个细胞线粒体表面数量少于对照组,但每个细胞中每个表面的体积,mdivi-1处理组明显增大（P<0.05）。（7）给予5-FU应激处理小鼠体内注射mdivi1和DMSO处理后11天骨髓细胞中供者细胞占比明显低于对照组（*P<0.05）,处理后的小鼠骨髓细胞进行移植后流式细胞学分析,mdivi组外周成分血细胞占比均明显低于对照组（50K:*P<0.05;140K:*P<0.05）。结论:以上研究表明,线粒体动力蛋白Drp1的缺失会导致线粒体的形态结构发生与移植后一致的改变,线粒体变得更紧缩、融合,在细胞内的分布变得不均匀,从而影响线粒体的功能发挥。并且这种影响会被HSC携带至细胞复制分裂后的子代细胞中,最终改变细胞的命运转归和结局。