背景:在器官获得,器官移植,器官部分切除,创伤或休克过程中,缺血再灌注损伤(IRI)所引起的局部无菌性炎症反应是一个先天性免疫的必然标志性事件。在移植后的早期阶段缺血再灌注损伤常会导致肝脏失去功能或肝脏功能障碍,并可能导致急性和慢性排斥反应事件的发生率增加。此外,由于边缘性的肝脏受到缺血再灌注损伤尤其明显和严重,缺血再灌注损伤是造成供肝短缺的情况的重要因素。肝脏内皮细胞(LECs)是肝血窦的血管壁的重要组成。肝脏内皮细胞在控制血管稳态、血管炎症、血管张力,和血管清除毒物方面发挥着重要的保护性的作用。在肝脏低温保存的过程中,肝内皮细胞受到损伤属于肝脏缺血再灌注损伤的一部分,可以引起移植物微循环不畅,粘附分子的表达上调,氧化应激反应增加,进一步放大和加强中性粒细胞浸润和损伤作用,进而引起肝细胞坏死。选择素家族是表达于内皮细胞,血小板,白细胞上的凝集素域糖蛋白,在缺血再灌注损伤初始发生过程中发挥介导初始趋化、介导白细胞聚集,以及白细胞在内皮细胞表面粘附运动的作用。在细胞瀑布样粘附级联过程中,P-选择素糖蛋白-1(PSGL-1,CD162)是P-选择素唯一已知的高亲和力配体。为了进一步了解研究粘附素分子拮抗剂在肝脏缺血再灌注损伤引起的炎症和细胞内氧化还原稳态中的作用,我们构建了一个新的可溶性重组融合抗体,即"TSGL-Ig",其中"T"的意思为"tandem",就像马车并排的两匹马一样,有双重的PSGL-1结合位点。已经有大量的体内和体外实验研究表明,相较于先前的重组PSGL-Ig,该TSGL-Ig被赋予了更高的与选择素结合的能力,作为竞争性拮抗剂拮抗白细胞与选择素的结合。氧化应激引起的活性氧(ROS)的过量产生是肝脏缺血再灌注损伤过程中肝细胞损伤关键性的病理生理因素。Keap1-Nrf2-AREs信号通路在处理过量的活性氧的生产,以及维持细胞的氧化还原平衡及代谢发挥不可缺少的作用。因此,本研究试图阐明缺血再灌注损伤氧化应激过程中内皮细胞受损的分子机制,并为TSGL-Ig在肝移植中的使用并提高患者预后提供实现可能的依据。目的:本研究旨在通过模拟临床相关的小鼠原位肝移植模型来检验在肝移植供肝被长时间冷保存过程中TSGL-Ig在减少肝缺血再灌注损伤中的疗效和机制。实验预计TSGL-Ig会黏附到内皮细胞的选择素上,并在缺血再灌注损伤减少中发挥关键作用。我们想知道TSGL-Ig是否通过引起内皮细胞Nrf2蛋白活化增加并进入细胞核,并引起下游抗氧化应激基因激活来发挥维持细胞内稳态的作用。我们设想TSGL-Ig在小鼠肝移植模型中是通过粘附于内皮细胞上的选择素引起Keap1-Nrf2-AREs通路依赖的途径来减少来保护内皮细胞,减少细胞损伤,并以此作为提高肝移植患者的预后的切实有效治疗方法。方法:1.动物。8-12周雄性C57BL/6野生型小鼠(WT)及C57BL/6野生型小鼠背景下肝脏Nrf2基因条件性敲除小鼠(基因敲除检测至少十二代以上)。2.原位肝移植模型。从WT或Nrf2 KO小鼠取得的肝脏被存储在20小时4℃UW液中在植入同种受体之前。三组WT受体在肝切除时和再灌注之前接受TSGL-Ig,rPSGL-Ig,或对照免疫球蛋白处理。3.热缺血再灌注损伤模型。在小鼠肝节段70%热缺血再灌注损伤模型。4.肝细胞功能检测。测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT),以评估肝脏缺血再灌注损伤的严重程度。5.组织病理学。肝脏标本(4μm),用苏木精和伊红染色(H&E),双盲法分析肝脏的结构损伤情况。6.髓过氧化物酶活性测定。髓过氧化物酶(MPO)是作为中性粒细胞在肝脏中积累的指标。7.荧光定量PCR。用PCR进行肝脏细胞因子及趋化因子表达情况分析,以及检测Nrf2下游基因的表达状态。8.Western blot。用来分析肝移植模型中Nrf2蛋白在细胞质和细胞核中的表达情况。9.细胞培养。小鼠原代细胞提取后培养在完全DMEM培养基中。10.乳酸脱氢酶/丙氨酸氨基转移酶释放试验。测定细胞培养过程中培养液中乳酸脱氢酶/谷丙转氨酶释的含量,来测定培养原代肝细胞的损伤水平。11.统计分析。所有值都表示为平均值±标准差(SD)的形式。p<0.05被认为有显著的统计学意义。结果:1.TSGL-Ig提高了提高小鼠原位肝移植后的生存率,并且改善和减少了肝缺血再灌注损伤。首先,我们发现TSGL-Ig处理过的小鼠接受同种原位肝移植术后,比对照免疫球蛋白处理组的生存率明显要高,超过90%的TSGL-Ig处理组小鼠在接受移植后14天仍然存活,对照免疫球蛋白处理组的存活率不到TSGL-Ig处理组的一半。随后,我们用血清学分析移植受体肝细胞功能,H&E染色观察肝组织病理切片结构,发现TSGL-Ig处理组的肝脏保护程度要明显优于对照组。2.在原位肝移植模型中TSGL-Ig抑制中性粒细胞和巨噬细胞聚集。实验结果提示与TSGL-Ig显著降低肝移植模型中缺血过程中性粒细胞和巨噬细胞聚集。髓过氧化物酶活性测定实验与免疫组化的数据一致,TSGL-Ig组的中性粒细胞活动降低。3.TSGL-Ig抑制缺血再灌注介导的肝细胞因子及其趋化因子表达。荧光定量PCR结果提示移植6小时后,相对于对照组免疫球蛋白处理组,TSGL-Ig处理组的中性粒细胞/单核细胞源性炎症趋化因子(CXCL-1,CXCL-10)和细胞因子(TNF-α,IL-1β and IFN-β)均被抑制减少。4.TSGL-Ig缺血再灌注引起的肝脏氧化应激和细胞坏死/凋亡。5.TSGL-Ig调节缺血再灌注诱导的内皮细胞激活。再灌注后损伤急性期P/E选择素和VCAM-1/ICAM-1的表达先明显上升,其后缓慢下降。并且,TSGL-Ig在原位肝移植模型中显著减少了内皮细胞相关的细胞黏附分子基因的表达。6.TSGL-Ig通过Nrf2依赖的通路来保护内皮细胞免受缺血再灌注损伤。Western Blot实验证明原位肝移植模型中缺血再灌注损伤会引起细胞质和细胞核内的Nrf2表达增高。TSGL-Ig处理组引起Nrf2相关的下游靶基因(Trx,GCL,NQO1,and HIF-1α)表达升高。体外实验同样也证实了这一点。然后我们用Nrf2条件性敲除小鼠来探究TSGL-Ig的细胞保护机制并且发现,Nrf2信号通路被阻断后,内皮细胞更易受到氧化应激损伤。与野生型小鼠相比,Nrf2条件敲除小鼠的原代内皮细胞虽然经过TSGL-Ig预处理,并不能起到保护内皮细胞的作用。7.缺血再灌注损伤环境下,Nrf2通路在TSGL-Ig表现的肝保护作用过程中起到了不可缺少的作用。结论:1.TSGL-Ig具有提高原位肝移植存活率并减轻肝脏一直过程中缺血再灌注损伤的作用,可以减轻缺血再灌注介导的氧化应激反应,减少细胞凋亡/坏死。2.在缺血再灌注损伤中,TSGL-Ig通过Nrf2相关的途径来起到调节内皮细胞的保护作用,并且Nrf2-AREs信号通路在TSGL-Ig细胞保护作用中起到了不可缺少的重要作用。