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帕金森病(Parkinsons disease,PD)是一种高发于中老年人的中枢神经系统变性疾病,65岁以上人群患病率高达1.7﹪;疾病缓慢进展造成病人残障,严重危害中老年人的身心健康和生活质量.疾病的典型病理改变是中脑黑质多巴胺(DA)能神经元退变、丢失和胞浆内嗜酸性包涵体(即路易小体)形成.发病机制迄今尚未明了,涉及基因突变、氧化应激、线粒体功能障碍、炎性反应等诸多方面,目前仍缺乏有效的病因治疗手段.DA能神经元在中枢神经系统(CNS)分布非常广泛,酪氨酸羟化酶(TH)作为DA合成的限速酶是其特异性的标志物.DA能神经元在CNS主要有视网膜(A17)、嗅球(A16)以及间脑的DA能神经元(A11-14).然而,脑内最大的一群DA能神经元在中脑腹侧.根据它们的解剖位置以及神经投射,进行功能分组亚群,被命名为黑质致密部(SNc,A9)以及腹侧被盖区(VTA,A10). 中脑DA能神经系统在帕金森病的发病过程中起着非常重要的作用,而在中枢神经系统发育过程中,转录因子Lmxlb极有可能参与中脑DA能神经元的分化、成熟过程.Lmx1b是LIM同源盒转录因子,最早发现在肢芽的发育中起重要作用,而且它在中脑DA能神经元、后脑5-羟色胺能神经元、延脑和脊髓后角神经元中特异表达,该基因突变在人类导致一种常染色体显性遗传病,称谓指甲膑骨综合征.
首先我们利用基因敲除的方法研究Lmxlb在小鼠中脑和后脑发育中的作用,发现胚胎第七天Lmxlb开始表达在胚胎的前侧(神经外胚层,将来发育成脑),至第九天表达逐渐局限到菱脑峡部位,提示Lmxlb基因可能在中后脑的发育过程中起作用;生后Lmxlb基因敲除小鼠的中脑和小脑都变小,组织失状切片染色以及免疫组化的方法进一步发现中脑下丘消失,缩小的中脑上丘与小脑直接连在一起,而小脑变得很小,中部没有融合.分析基因敲除小鼠胚胎中脑和后脑部位的基因表达,发现大约胚胎第九天菱脑峡内很多基因发生缺失,应该在四个体节就开始表达的Fgf8完全缺失,同时Wnt1的表达下调.其他基因如转录因子Enl和Pax2的表达也发生下调,而Gbx2的表达在4个体节的阶段才下调.该胚胎Otx2和Pax6的表达并没有受到影响,说明Lmxlb控制着菱脑峡的诱导功能,但不影响菱脑峡的定位.Wntl驱动的Cre重组酶小鼠区域特异性敲除Lmxlb的研究进一步证实了在菱脑峡内Lmxlb表达对中脑和后脑发育的重要性.结果表明,在中脑顶盖(上丘和下丘)和小脑的发育过程中,Lmxlb通过调节菱脑峡内Fgf8、Wnt1以及其它菱脑峡发育相关的转录因子的表达,在中脑和后脑早期发育中起重要作用.
中脑DA能神经元的正常发育是以神经管中脑后部和后脑前部交界处(MHB)的正常发育为前提,并沿吻尾(AP)轴和背腹(DV)轴有序分化,逐渐向中脑腹侧迁移.DA能神经元的发育是一个包括多种转录因子和生长因子参与的严格控制过程.近年发现,Lmxlb也参与了中脑DA能神经元的早期分化,为了进一步研究Lmxlb基因与其他转录因子或生长因子在中脑DA能神经元发育和成熟过程中的作用.我们构建了在小鼠中脑DA能神经元中特异性表达他莫昔芬依赖性Cre重组酶的转基因小鼠.我们利用同源重组的方法构建了带有全部TH基因的细菌人工染色体(BAC)介导的CreER转基因载体,该载体通过显微注射被导入小鼠受精卵中,通过胚胎移植,获得首建转基因小鼠.通过PCR和LaCZ染色以检测子代小鼠CreER重组酶在体内介导重组的功能.共注射101枚受精卵,移植至3只假孕母小鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠18只,经.PCR鉴定有2只小鼠在基因组上整合有CreER_T2基因,整合率为11﹪.与"报告"小鼠-ROSA26交配,成年后注射他莫昔芬后,LacZ染色后中脑黑质区检测到Cre重组酶活性.结果成功构建了在中脑DA能神经元特异表达CreERT<2>重组酶的转基因小鼠,为进一步阐明帕金森病的发病机制以及构建时空特异Lmxlb基因敲除小鼠模型打下了坚实的基础.