肿瘤是当前严重危害人类健康的常见疾病之一,其主要是由于各种环境致癌因素导致机体正常细胞发生恶性转化的结果。苯并(a)芘(BaP)是常见的环境致癌物,近年已有研究发现BaP暴露能导致细胞DNA损伤修复相关信号通路改变,从而诱导细胞发生DNA损伤导致细胞恶性转化。砷是人类确定致癌物,低水平砷可通过抑制DNA损伤修复功能而促进其他环境致癌物如香烟等的致癌作用。缺氧诱导因子(HIFs)是一个具有多种调节机制的转录因子,一些环境化学物也能诱导细胞产生HIFs,从而导致细胞基因组不稳定,进而使细胞发生恶性转化。已往对环境污染物致癌作用及其分子机制研究多集中在单一和／或高水平环境致癌物上,而低水平混合物的毒作用及其分子机制研究报道甚少,而实际工作和生活中,人们接触环境污染物往往又是低水平混合暴露,所以,研究几种环境污染物的联合损伤效应及其分子机制将对于认识环境污染所致机体健康的危害和研究其防治措施更有意义。为此,本课题拟探讨低水平亚砷酸钠(NaAsO2)和BaP分别及联合慢性处理对人肺支气管上皮(HBE)细胞恶性转化的影响；采用多种分子生物学方法观察DNA损伤修复指标和细胞恶性程度指标变化情况,并应用抑制剂或siRNA等技术阻滞或关闭HIF-2α后,观察其对相关蛋白和细胞恶性转化的影响,探讨HIF-2α在低水平NaAsO2促进BaP所致HBE细胞恶性转化过程中的作用及其分子机制,以揭示NaAsO2和BaP联合暴露对机体健康影响的部分分子机制,从而进一步理解砷促癌的分子机制和寻找砷和BaP及其联合中毒的早期生物学标志和发现新的防治措施提供新线索。方法一、不同水平BaP和亚砷酸钠对HBE细胞DNA损伤和细胞凋亡的影响分别用0.0、0.5、1.0、5.0或10.0μM BaP处理HBE细胞24h,或分别用0.0、0.5或1.0μM NaAsO2预处理HBE细胞24h后,再联合0.0或1.0μM BaP处理HBE细胞24h,然后全部换成新鲜培养液分别继续培养0、3、24和48h(让细胞自行修复DNA损伤0、3、24、48h),用彗星实验检测细胞DNA损伤程度,用Hoechst33258染色检测细胞凋亡水平,以观察不同水平NaAsO2和BaP分别和联合处理对HBE细胞DNA损伤、细胞凋亡和DNA损伤修复的影响。二、低水平亚砷酸钠对BaP所致HBE细胞恶性转化的影响本研究分为四个处理组,即空白对照组、单独NaAsO2组、单独BaP组、NaAsO2和BaP联合组,其用0.0或1.0μM NaAsO2和BaP分别或联合处理HBE细胞30代后,用软琼脂集落实验检测细胞恶性程度,用ArrayScan(?) Ⅱ高内涵技术平台检测HBE细胞24h迁移距离。以观察低水平NaAsO2和BaP分别和联合处理对HBE细胞恶性转化和迁移的影响。三、低水平亚砷酸钠对BaP所致HBE细胞基因组不稳定的影响用1.0μM NaAsO2和BaP分别或联合处理HBE细胞30代后,用Giemsa染液在显微镜下检测细胞染色体畸变情况,用免疫荧光实验和Western blot检测细胞γ-H2AX水平,观察低水平NaAsO2和BaP分别和联合处理对HBE细胞染色体畸变和γ-H2AX水平的影响。四、亚砷酸钠和BaP处理对HBE细胞DNA损伤修复通路的影响用1.0μM NaAsO2和BaP分别或联合处理HBE细胞6、12和24h后,用Western blot检测DNA损伤修复蛋白ATM、ATR、Chkl和Chk2水平及其磷酸化程度。分别用含0.0或1.0μM NaAsO2处理HBE细胞24h后,再分别换成含0.0或1.0μM BaP处理HBE细胞24h,酶联免疫反应法检测细胞8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶-1(8-hoGG1)水平。以观察低水平NaAsO2和BaP分别和联合处理对HBE细胞DNA损伤修复通路相关蛋白激活的影响。五、亚砷酸钠和BaP处理对HBE细胞HIF-2α水平及其功能的影响用1.0μM NaAsO2和BaP分别或联合处理HBE细胞30代后,或1.0μMNaAsO2和1.0μM BaP分别或联合处理HBE细胞6、12或24h后,用Western blot检测细胞HIF-1α和HIF-2α水平；分别用含0.0或1.0μM NaAsO2处理HBE细胞24h后,再分别换成含0.0或1.0μM BaP处理HBE细胞24h,用RT-PCR检测HIFs下游靶分子PGK、Oct4、VEGF mRNA水平,以观察低水平NaAsO2和BaP分别和联合处理对HBE细胞HIF-1α和HIF-2α水平及其下游靶分子的影响。六、HIF-2α在亚砷酸钠抑制BaP所致HBE细胞DNA损伤修复通路激活中的作用分别用20nM control siRNA或10μM HIF-2α siRNA预处理HBE细胞24h,再分别用0.0或1.0μM NaAsO2处理HBE细胞24h,然后后换成含0.0或1.0μMBaP的培养液继续处理HBE细胞24h,用Western blot检测细胞DNA损伤修复蛋白ATM、Chk2磷酸化程度及γ-H2AX水平；用免疫荧光检测细胞γ-H2AX表达水平,以观察HIF-2α在亚砷酸钠抑制BaP所致HBE细胞DNA损伤修复通路激活中的作用七、HIF-2α在亚砷酸钠促进BaP所致HBE细胞恶性转化中的作用各组细胞每代先用1.0μM Topo (HIF-2α抑制剂)预处理细胞3h后,再用1.0μM NaAsO2和BaP分别或联合处理HBE细胞30代,用软琼脂集落实验检测细胞恶性程度；用Giemsa染液在显微镜下检测细胞染色体畸变情况,以观察HIF-2α在低水平NaAsO2促进BaP所致HBE细胞恶性转化和染色体畸变中的作用。结果一、不同水平BaP和亚砷酸钠对HBE细胞DNA损伤和细胞凋亡的影响结果发现不同浓度BaP处理HBE细胞,随着BaP浓度增加Olive尾距不断增大,具有明显的剂量-效应关系；不同水平NaAsO2联合1.0μM BaP处理HBE细胞,Olive尾距随着NaAsO2浓度增加而增大,具有剂量-效应关系；0.5或1.0μMNaAsO2联合1.0μM BaP处理HBE细胞的细胞凋亡率与对照组无显著性差别；修复48h后,1.0μM BaP联合1.0μM NaAsO2处理组HBE细胞的修复程度最小。说明BaP可引起HBE细胞DNA损伤,低水平NaAsO2能够增强BaP所致细胞DNA损伤但未引起明显细胞凋亡,且能够抑制BaP所致DNA损伤修复作用。二、低水平亚砷酸钠对BaP所致HBE细胞恶性转化的影响结果发现单独BaP组、NaAsO2和BaP联合组两个组HBE细胞的软琼脂细胞集落数均高于传代对照组；NaAsO2和BaP联合组细胞集落数显著高于单独NaAsO2组和单独BaP组；单独,NaAsO2组、单独BaP组、NaAsO2和BaP联合组三个组HBE细胞的迁移距离和迁移斜率均显著高于传代对照组；其中NaAsO2和BaP联合组细胞迁移距离和迁移斜率也显著高于单(?)(?)NaAsO2组和单独BaP组。说明BaP慢性处理可以引起HBE细胞发生恶性转化,且低水平NaAsO2可增强BaP所致HBE细胞恶性转化和迁移性。三、亚砷酸钠对BaP所致HBE细胞基因组不稳定的影响结果发现单独BaP组、NaAsO2和BaP联合组两个组HBE细胞的染色体出现了多种染色体畸变形式,如染色体断裂、染色单体断裂、环状染色体和末端着丝粒等,其染色体畸变率均显著高于传代对照组HBE细胞；其中NaAsO2和BaP联合组HBE细胞的染色体畸变率显著高于单独NaAsO2组和单独BaP组HBE细胞；NaAsO2和BaP联合组HBE细胞γ-H2AX免疫荧光强度和蛋白水平显著低于单独BaP处理组HBE细胞。说明低水平NaAsO2可增加BaP所致HBE细胞染色体畸变率,并阻滞BaP所致HBE细胞DNA损伤修复指标γ-H2AX表达水平升高。四、亚砷酸钠和BaP处理对HBE细胞DNA损伤修复通路的影响结果发现单独BaP组HBE细胞的p-ATM和p-Chk2水平随处理时间延长而逐渐升高,具有时间-效应关系,NaAsO2和BaP联合组HBE细胞的p-ATM和p-Chk2水平在处理6h明显升高,然后随处理时间延长后又降低；NaAsO2和BaP联合组HBE细胞的8-hoGG1水平显著低于单独BaP组HBE细胞。说明低水平NaAsO2可抑制BaP诱导的HBE细胞ATM-Chk2损伤修复信号通路激活和8-hoGG1水平升高。五、亚砷酸钠和BaP处理对HBE细胞HIF-2a水平及其功能的影响结果发现单独NaAsO2组、NaAsO2和BaP联合组两个组HBE细胞的HIF-2α水平、Oct4和VEGF mRNA水平均显著高于对照组和单独BaP组HBE细胞；各组中的HBE细胞HIF-1α均未见表达；单独NaAsO2组HBE细胞的HIF-2a水平随处理时间延长而逐渐升高,具有时间-效应关系,NaAsO2和BaP联合组HBE细胞的HIF-2a水平在处理6h明显升高,然后随处理时间延长后又降低。说明低水平NaAsO2慢性处理引起HBE细胞HIF-2a水平、下游靶分子Oct4和VEGF mRNA水平升高,而且BaP可抑制NaAsO2所致HBE细胞HIF-2α水平升高。六、HIF-2α在亚砷酸钠抑制BaP所致HBE细胞DNA损伤修复通路激活中的作用结果发现单纯BaP组HBE细胞的p-ATM、p-Chk2和γ-H2AX水平及γ-H2AX荧光强度均显著高于对照组,NaAsO2和BaP联合组HBE细胞的p-ATM. p-Chk2和γ-H2AX及γ-H2AX荧光强度均明显低于单纯BaP组HBE细胞；而用HIF-2a siRNA预处理关闭HIF-2a后,NaAsO2和BaP联合组HBE细胞的p-ATM、p-Chk2和γ-H2AX水平及γ-H2AX荧光强度又明显回升。说明低水平NaAsO2对BaP所致ATM-Chk2通路激活和DNA损伤修复蛋白γ-H2AX水平升高具有抑制作用,而HIF-2a在此过程中具有重要作用。七、HIF-2α在亚砷酸钠促进BaP所致HBE细胞恶性转化中的作用结果发现经过HIF-2α抑制剂Topo的预处理后,只有单独BaP组HBE细胞所形成的集落数显著高于传代对照组HBE细胞; NaAsO2和BaP联合组经过HIF-2a抑制剂Topo的预处理后,细胞集落数相对于传代对照组均没有统计学差异；经过HIF-2a抑制剂Topo的预处理后单独BaP组的染色体畸变率显著高于传代对照组HBE细胞,单独NaAsO2组、NaAsO2和BaP联合组染色体畸变率相对于传代对照组均没有统计学差异。说明HIF-2a在低水平NaAsO2促进BaP所致HBE细胞恶性转化和染色体畸变过程中具有重要作用。结论1、BaP可引起HBE细胞DNA损伤,低水平NaAsO2能够增强BaP所致细胞DNA损伤、染色体畸变,且能够抑制BaP所致DNA损伤修复作用。2、BaP慢性处理可以引起HBE细胞发生恶性转化,且低水平NaAsO2可增强BaP所致HBE细胞恶性转化和迁移性。3、HIF-2α调控ATM-Chk2损伤修复通路在低水平NaAsO2促进BaP所致HBE细胞恶性转化中具有重要作用。总之,本研究结果提示低水平亚砷酸钠能引起HIF-2α高表达,BaP处理细胞能够诱导DNA损伤,进而激活ATM-Chk2损伤修复通路,HIF-2α又能抑制此通路的激活,导致损伤不能被修复,最终导致细胞恶性转化,从而说明HIF-2α调控ATM-Chk2通路在砷促进苯并(a)芘所致细胞恶性转化中的作用。