目前,脑血管病已成为人类死亡的首要疾病,并且具有患病率高、致残率高、死亡率高、复发率高的特点,其中脑梗死约占脑血管病的85%,因此研究和防治脑梗死具有极其重要的社会意义。据报道对脑梗死的的治疗效果不尽如人意,脑梗死后神经功能的损伤是患者致残的主要原因。神经元突起损伤是导致神经功能障碍的重要原因。如何促进神经元突起的生长是脑梗死后期治疗的关键。脑梗死导致脑组织受到不同程度的损伤,神经网络结构被破坏,从而导致神经功能受损。而神经可塑性又可以促使形成新的丰富神经网路结构并能修复病变,从而改善缺血脑组织的神经功能。因此研究给予药物等加强神经修复的作用显得尤为重要。由于神经元突起对于神经网络结构的修复具有重要意义,因此,寻找能够有效促进神经元突起生长的药物,是当前面临的重要并且热点课题。Sonic hedgehog(Shh)是分泌性糖蛋白因子,在胚胎和神经系统发生、发育和分化中可调控神经细胞的增殖、分化和轴突的形成。国内外研究报道大鼠脑缺血中,Shh可通过调节神经细胞的增殖、分化和突起的形成发生来促进神经元可塑性,并且参与调控脑组织室下区神经再生。然而,到目前为止,查阅大量文献后发现Shh蛋白对大脑皮层神经元细胞神经突起的作用及其机制仍未明确,仍需深入研究,这对增强神经环路的研究具有重要意义。氧化应激是脑梗死的重要病理生理机制,应用氧化应激模型有助于理解脑梗死的发病机理并开展相关治疗。因此本课题利用皮层神经元的氧化应激模型来模拟脑梗死后皮层神经元的损伤,研究Shh蛋白对氧化应激下皮层神经元细胞的保护作用。线粒体是能量产生的主要场所,可在控制神经重构包括神经分化、神经突生长、神经递质释放以及树突重构等的基本过程中发挥着重要的作用。线粒体功能失调可能在脑梗死后神经重塑中具有重要作用。调节脑梗死后线粒体的形态和功能可以介导神经突起的生长,而神经突起的生长是一个能量消耗的过程,需要足够的能量供应,因此,能量的代谢和线粒体与神经突起的生长高度相关。研究报道激活经典的shh调节的信号通路可以增加线粒体活性。但是关于shh对于氧化应激后皮层神经元线粒体的影响报道较少,仍需深入研究。综上所述,本研究首先利用孕15-18天c57bl/6胎鼠确立小鼠皮层神经元细胞的原代培养模型,其次利用此模型观察shh蛋白对皮层神经元神经突起的生长的促进作用,并探讨其可能的影响机制,最后利用皮层神经元的氧化应激模型来模拟脑梗死,观察shh对皮层神经元的活性和神经突起的作用,并从线粒体和能量代谢的角度探讨shh对氧化应激下皮层神经元及其突起发挥保护作用的机制。本研究分为三部分,现将各部分内容概述如下。第一部分小鼠皮层神经元细胞的原代培养及细胞鉴定目的:通过对孕15-18天内c57bl/6胎鼠皮层神经元的原代培养,掌握小鼠皮层神经元的原代培养方法,并观察细胞的形态学;利用免疫细胞化学鉴定所培养的细胞是否为神经元细胞,以备后续实验。方法:c57bl/6雌雄小鼠交配获取孕15-18天胎鼠,麻醉后断头取脑,于预冷1×hbss溶液的平皿中,在解剖显微镜下取出完整的大脑及小脑,夹除小脑,将大脑半球放入盛有预冷的1×hbss溶液的平皿中,在解剖显微镜下剥离脑膜,分离出皮层组织。将其剪碎放入15ml塑料离心管离心管内加入3mlpapain消化液(新鲜配制),37°c孵育箱内孵育15~30分钟弃去papain消化液,加入3mlhibernatee洗涤,反复直至变成细胞悬液,200rpm离心3分钟,弃去上清,加入含2%b27的neurobasal培养液,制成单细胞悬液,种植于poly-l-lysine处理过的培养皿中,于湿润的培养箱中培养(37℃,5%co2),并于不同时间点于显微镜下观察所培养的原代皮层神经元细胞的生长情况并记录。取培养1天皮层神经元,4%多聚甲醛固定,0.3%triton-x100破膜打孔作用15分钟,10%驴血清室温封闭45分钟,加入抗鼠神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,nse)和兔抗鼠的胶质细胞中间丝蛋白胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,gfap)一抗4℃过夜,然后加入驴抗小鼠fitc(1:200),驴抗兔tritc(1:200),37℃,1h,荧光封片剂后于荧光显微镜下观察神经元并鉴定神经元细胞。结果1皮层神经元细胞刚接种时的细胞为圆形,2小时后开始贴壁,培养至6~8小时后,少数神经元细胞可见有明显的细胞突起的生成。培养第24小时后,神经元细胞胞体清晰、丰满,胞体呈现锥体或星形,光晕的轮廓较明显,细胞突起增长。培养第2天,细胞胞体增大,更清晰,突起明显变长,而且突起之间形成了一定的联系。培养第3天,绝大多数神经元细胞的突起已经相互连接,并形成网络结构。2本实验应用免疫荧光法检测发现nse标记的神经元细胞在视野中出现较多,并显示出完整的神经元形态,而且细胞胞体丰满,突起生长较多;视野中未发现gfap标记的胶质细胞。结论1本实验利用无血清培养法成功建立了小鼠大脑皮层神经元细胞的原代培养模型,具有稳定性高、纯度高和存活率高的皮层神经元细胞,是一种研究神经科学的理想模型。2本试验利用免疫荧光法对所培养神经元细胞的鉴定结果提示对胎鼠脑皮层细胞进行原代培养获得的神经元细胞存活率高,纯度高,为后续实验打下了良好的基础。第二部分shh蛋白对皮层神经元神经突起的作用及与bdnf机制研究目的:观察shh蛋白对小鼠皮层神经元细胞神经突起的生长作用,并探讨shh蛋白对皮层神经元神经突起的作用及其相关的可能机制。方法:取孕15-18天的c57bl/6小鼠的原代培养的皮层神经元进行实验,分为对照组、不同浓度的shh(5,50,500ng/ml)组、shh信号通路抑制剂环耙明(cyclopamine,cpm)组、cpm+shh组和酪氨酸激酶抑制剂k252a+shh组。抑制剂在加入shh蛋白前30min提前加入,药物作用于神经元细胞24小时后进行后续实验。利用免疫荧光法检测神经元细胞中shh受体(ptch)的表达;β-tubulin免疫荧光细胞化学染色法测定shh对皮层神经元神经突起的生长长度;rt-qpcr法检测神经元细胞中shh和ptch基因水平表达;rt-qpcr和western-bloting法检测神经元细胞中bdnf基因和蛋白水平表达;免疫荧光细胞化学染色法测定神经元神经突bdnf的含量;按照bdnf试剂盒说明书采用elisa法测定神经元培养液中bdnf的含量。结果1首先证实shh受体—ptch在皮层神经元细胞存在,提示shh蛋白可能对调节皮层神经元神经突的生长具有生物学效应。250ng/ml和500ng/ml的shh蛋白组能够明显促进神经元神经突起的生长(p<0.05)。特别有趣的是,50ng/ml的shh蛋白组对神经突起的生长的促进作用更加明显,因此,后续实验选用shh浓度为50ng/ml进行。3与单用shh蛋白组相比,shh和cpm共同作用后能够显著降低神经突起的长度(p<0.05),提示shh介导的神经突起的生长作用部分能被cpm阻断。4shh蛋白干预均能够诱导细胞中shh和ptch的基因表达增加,给予cpm后,shh诱导细胞中shh和ptch基因表达增加均部分被抑制(p<0.05)。5shh蛋白干预能够使神经元细胞bdnf在mrna和蛋白水平上增加,给予cpm后,shh介导的bdnf的表达增加被抑制(p<0.05)。6shh蛋白干预能够使神经元细胞的神经突起中bdnf表达增加,与cpm联用后,这种增加部分被抑制。7shh蛋白干预能够使细胞培养液中bdnf的含量也增加,给予cpm后,细胞培养液中bdnf的含量增加也被抑制(p<0.05)。8与单用shh组相比,k252a和shh联合作用组对皮层神经元神经突起的生长长度有所降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:本试验结果显示小鼠皮层神经元细胞中存在shh受体-ptch,并且shh蛋白能够促进皮层神经元神经突起的生长,shh蛋白可能部分通过激活shh信号通路实现其对脑皮层神经元的神经突起的促生长作用;此外shh蛋白还可能通过促进bdnf的表达来发挥其对神经突起的促生长作用,最终实现shh蛋白的神经保护作用。第三部分shh蛋白对氧化应激下皮层神经元活性和神经突起的作用及其线粒体机制研究目的:观察shh蛋白对氧化应激下小鼠皮层神经元细胞的活性影响和神经突起的生长作用的影响,观察shh蛋白对氧化应激下皮层神经元细胞中活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)、超氧化物岐化酶(superoxidedismutase,sod)及丙二醛(malondialdehyde,mda)的影响,并检测shh蛋白对氧化应激下线粒体形态和功能的影响以及对能量代谢和线粒体氧化呼吸链复合物酶ii的影响,进而探讨shh蛋白对氧化应激下皮层神经元的活性和神经突起的作用及其可能的线粒体和能量代谢机制。方法:取孕15-18天c57bl/6小鼠的胎鼠,取其皮层组织,进行细胞原代培养。皮层神经元培养24小时后,加入100umh2o2处理2h,然后换液继续以神经元培养液培养,体外模拟脑缺血模型。实验分为对照组、h2o2组、h2o2+shh组进行后续实验。利用cck-8法检测shh蛋白对氧化应激下皮层神经元的细胞活性的影响;利用β-tubilin免疫荧光细胞化学染色法测定shh蛋白对氧化应激下皮层神经元神经突的长度的作用;western-bloting检测各组皮层神经元细胞中gap-43蛋白水平表达和免疫荧光细胞化学染色法测定各组中皮层神经元细胞gap-43的表达;利用用活性氧检测试剂盒测定各组神经元细胞内的ros的表达变化,结果为所检测得的荧光值与对照组的荧光度的比值(%ofcontrol)表示;根据sod和mda说明书的说明步骤测定shh蛋白对各组细胞中sod活性和mda的含量表达变化;通过透射电镜观察各组中皮层神经元线粒体形态的改变;利用线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1)检测各组神经元细胞线粒体膜电位(mmp)的变化情况。利用atp活性试剂盒检测各组皮层神经元atp活性的变化情况;利用线粒体呼吸链复合物酶ii试剂盒分析各组神经元细胞线粒体呼吸链复合物酶ii活性。结果1cck-8法检测结果h2o2能够降低神经元细胞的活性,当加入shh蛋白后,细胞活性的能力增强,50,500ng/ml的shh能显著促进氧化应激的神经元细胞存活率。2与对照组相比,神经元受到h2o2作用后,其神经突起的生长损伤(p<0.05),而在h2o2作用后加用shh蛋白后神经元神经突的生长得到一定程度的恢复(p<0.05),结果具有统计学差异。应用免疫荧光和westernblot法检测细胞中gap-43的实验结果显示h2o2作用于神经元细胞后gap-43的表达降低,而加入shh蛋白后其表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05),进一步证实shh蛋白能改善氧化应激损伤的皮层神经元神经突起的生长。3与对照组相比,h2o2作用于皮层神经元后,其细胞内ros含量升高,sod活性下降,mda含量升高,而给予shh蛋白干预后,神经元细胞内ROS含量下降,SOD活性上升,MDA含量下降(P<0.05)。4透射电镜显示,与对照组相比,H2O2作用后神经元内的线粒体损伤严重,线粒体肿胀,空泡化,并且结构也破损。当加入Shh蛋白干预后,线粒体形态得到一定程度的恢复,空泡化和肿胀的线粒体减少。MMP结果显示,与对照组相比,H2O2作用于皮层神经元后,神经元细胞的MMP下降,而给予Shh蛋白干预后,神经元细胞的MMP较之上升(P<0.05)。5 ATP检测结果显示,H2O2组细胞的ATP的量与对照组相比明显下降,Shh蛋白干预后,神经元细胞的ATP量有所好转,差异具有统计学意义(P<0.05)。6 H2O2作用于神经元后线粒体呼吸链复合物酶II的活性下降,而在氧化应激后给予Shh蛋白治疗后,其活性较H2O2组好转(P<0.05)。结论:本试验利用氧化应激模型模拟脑缺血状态,研究发现Shh蛋白能促进氧化应激的皮层神经元的存活和神经突起的生长。Shh蛋白可能通过降低ROS,上调SOD的活性,减少MDA含量,也通过修复线粒体复合物酶II的活性逆转氧化应激导致的能量的生成障碍,并能保护皮层神经元的线粒体形态和功能对氧化应激状态下的神经元起到保护和营养(促神经突起生长)的作用。