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水污染是一个重要的环境问题,氮素是水体的主要污染源之一。目前采用硝化-反硝化工艺去除污水中的氮素,氨氧化细菌是氮素去除中起主要作用的微生物,可将氨态氮转化为亚硝态氮。但因其生长速率缓慢,较难培养且不易分离到纯种菌株,仍然是污水脱氮处理的一个限制性因素。因此,构建快速生长、易培养的生物脱氮菌株将促进生物脱氮技术的发展。本研究从土壤富集液中克隆了氨氧化细菌的两个功能基因(amoA基因和hao基因),并将这两个基因共同表达于大肠杆菌B L21(DE3)中,构建了具有氨氧化功能的大肠杆菌工程菌。本论文的研究结果如下：(1)从土壤富集液中提取DNA,利用氨氧化细菌的特异引物PCR扩增amoA和hao基因序列,PCR产物分别连接克隆载体pMD18-T,转化大肠杆菌DH5a,经菌落PCR筛选,挑选目标片段的重组子测序及Blast分析,获得两种功能基因序列。结果表明amoA和hao基因分别与Nitrosomonas sp.GH22和Nitrosomonas sp. ENI-11序列同源相似性达到99%。(2)采用生物信息学对AmoA和Hao结构和功能进行分析,结果表明：AmoA氨基酸全长为276个,分子质量为31.94 kDa,属于不稳定的疏水性蛋白,该蛋白含有6个潜在跨膜螺旋区,三级结构显示空间构象不对称；Hao氨基酸全长为570个,分子质量为64.27 kDa,属于稳定的亲水性蛋白,该蛋白含有1个潜在跨膜螺旋区,三级结构显示空间构象不对称。(3)将amoA和hao基因分别连接到表达载体pQE30和pET28a,构建重组原核表达载体pQE30-amoA口pET28a-hao,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)中,RT-PCR证实基因得到表达,然后测定AmoA和Hao粗酶液活性。以硫酸铵为底物,AmoA粗酶液的氨氮降解率为90.6%,以盐酸羟胺为底物,Hao粗酶液的羟胺降解率为86.3%,说明AmoA和Hao蛋白粗酶液具有一定的酶活性。(4)质粒pQE30-amoA和pET28a-hao,同时转化大肠杆菌BL21(DE3),经过双抗平板和菌落PCR筛选后,得到重组菌BL21 (DE3)-pQE30-amoA-pET28a-hao, RT-PCR证实两个基因均在重组菌中得到表达,扩大培养,测定此菌株的氨氮降解能力,培养60 h后氨氮的最大降解率达到92.0%,说明菌株BL21 (DE3)-pQE30-amoA-pET28a-h65tgr .1``````.ao具有一定的脱氮活性。综上所述,本研究构建了一株具有氨氧化功能的大肠杆菌工程菌,在氨氮污水处理中有一定的应用价值。