研究背景： 在细胞内，存在着一种蛋白质翻译后修饰机制--乙酰化修饰，由蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)与组蛋白乙酰化酶(histoneacetylase，HAT)调节着组蛋白和非组蛋白的乙酰化平衡．HDAC促使底物蛋白去乙酰化，而HAT则相反。乙酰化平衡维持着细胞的正常增殖、分化和凋亡等生命活动，细胞内HDAC的高表达或异常募集将打破细胞内的乙酰化平衡，导致细胞异常增殖、分化受阻和凋亡抵抗，与肿瘤细胞的发生发展密切相关。新一代的分子靶向药物组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过抑制HDAC可以达到治疗肿瘤的目的。已有研究发现，HDAC的异常募集参与了非霍奇金淋巴瘤的主要发病机制，姜黄素的抗淋巴瘤机制可能也涉及HDAC这一靶点，然而其具体机制目前还尚不清楚。 HDAC6属于Ⅱ类HDAC。在哺乳细胞内HDAC蛋白家族不同类别的成员其功能侧重不同，所以参与肿瘤发生的机制也有差别。目前研究哺乳动物细胞主要存在四类HDAC，对Ⅰ、Ⅱ类的研究目前相对比较明确。Ⅰ类HDAC，包括HDACl、2、3、8，主要位于核内11，促使核小体的组蛋白去乙酰化而与抑制基因转录有关；Ⅱ类HDAC，包括HDAC4、5、6、7、9、10，主要位于胞浆，负责细胞浆内大量非组蛋白的去乙酰化，介导蛋白质的降解及相互作用等功能改变。近年来越来越多的研究提示HDAC的非组蛋白乙酰化功能在肿瘤发生中扮演着更为重要的角色。HDAC6作为最重要的Ⅱ类HDAC，同时也是胞浆蛋白去乙酰化的关键酶，目前研究示在多个肿瘤细胞系高表达，可从侵袭素、泛素化等多个途径参与肿瘤的发生发展而令人瞩目。已有报道NHL中存在Ⅰ类HDAC分子的异常表达并与其发病机制有关，但是Ⅱ类分子包括HDAC6的表达情况，HDAC6对非组蛋白去的乙酰化作用及是否同时参与NHL的发病机制目前尚不清楚。姜黄素系一种酚类色素，源自姜黄素属植物的块根或块茎，是中药姜黄的主要活性成分。抗癌是姜黄素的主要活性之一。在体外能够选择性地诱导B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkins lymphoma，B-NHL)细胞系细胞发生凋亡和细胞周期阻滞，而对正常细胞相对无明显毒性作用。姜黄素的抗肿瘤机制可能涉及其潜在的HDACi作用，目前对姜黄素HDACi机制的研究为数不多，并局限于其影响I类HDAC的范畴。有研究报道在NHL细胞株，抑制Ⅰ类HDAC的异常高表达，逆转核小体组蛋白H3、H4的过度去乙酰化，重新激活转录受阻的基因可能是姜黄素发挥HDACi的机制之一。然而姜黄素在调节Ⅰ类HDAC分子的同时是否作用于Ⅱ类HDAC分子包括HDAC6，以及在对非组蛋白乙酰化的影响方面目前未见研究报道。 非组蛋白Hsp90是肿瘤治疗的新分子靶点，新一代的Hsp90抑制剂已进入临床研究，但由于都有较强的毒副作用，因此寻找新的Hsp90抑制剂是目前的一个研究热点。Hsp90是热休克蛋白家族中最重要的分子伴侣蛋白，属于细胞内非组蛋白，能够发挥分子伴侣功能稳定其客户蛋白的构象使客户蛋白得以在细胞内稳定存在。由于Hsp90的客户蛋白大多数是细胞增殖、周期调控过程中的一些关键激酶以及肿瘤的特异性标志物，所以Hsp90的分子伴侣功能成为抗肿瘤的分子靶点。最新研究表明Hsp90的乙酰化是其发挥分子伴侣功能的关键，而且其乙酰化位点是广效HDACi的下游靶点，姜黄素作为一种潜在的HDACi是否也涉及到非组蛋白Hsp90的乙酰化修饰，目前更未见报道。由于HDAC6是负责细胞浆内多种蛋白可逆性乙酰化活动的重要酶，那么位于胞浆内的Hsp90的乙酰化极可能受到HDAC6的调控。假如姜黄素能够改变Hsp90的乙酰化水平，是否通过Ⅱ类HDAC途径，影响HDAC6对其底物蛋白Hsp90的去乙酰化作用这一机制，正是本实验研究目的所在。 综上所述，本实验旨在观察姜黄素对Ⅱ类HDAC—HDAC6和非组蛋白Hsp90的蛋白表达，以及Hsp90乙酰化水平的影响，同时探讨姜黄素调控肿瘤分子靶点Hsp90的可能机制，为进一步研究姜黄素的抗肿瘤分子机制以及淋巴瘤的靶向治疗提供依据。因此本研究分为以下三部分： 1.Ⅱ类HDAC—HDAC6在淋巴瘤细胞系Raji的表达情况。 2.姜黄素对Raji细胞Ⅰ、Ⅱ类}IDAC蛋白表达的影响。 3.姜黄素对Raji细胞Hsp90乙酰化的作用及机制研究。 第一章:Ⅱ类皿AC—HDAC6在淋巴瘤细胞系Raji的表达研究 目的：观察淋巴瘤细胞系Raji HDAC6的蛋白表b 达情况与正常外周血单个核细胞的差异。 材料与方法：细胞培养与分组B—NHL细胞株Raji培养于含20％的胎牛血清1640培养基。15例健康献血员外周静脉血用梯度离心法分离得单个核细胞为正常对照组。 Western blot分析检测肿瘤细胞Raji与15份正常外周血淋巴细胞的HDAC6的蛋白相对表达水平。 结果：淋巴瘤Raji细胞的HDAC6相对定量(HDAC6／GAPDH)在三次重复实验均明显高于正常对照组，正常对照组三次重复实验的组间}Tdac6总体均数的差异无统计学意义(F=1.011，P=0.372＞，提示Raji细胞存在HDAC6蛋白高表达。 结论：Ⅱ类HDAC—HDAC6蛋白在淋巴瘤细胞株Raji高表达。 第二章:姜黄素对Raji细胞Ⅰ、Ⅱ类皿AC蛋白表达的影响研究 目的：研究姜黄素能否同时调控Ⅰ类HDAC—HDACl和Ⅱ类HDAC—HDAC6的蛋白表达 材料与方法： 细胞培养与分组Raji培养于含20％的胎牛血清1640培养基，细胞分3组：空白对照组、25μtmol·L-1姜黄素处理组、和50μmol·L-1姜黄素处理组，以空白对照组为阴性对照组。 Western blot分析分别在姜黄素作用12、24、36小时后，检测各组细胞HDAClHDAC6的蛋白相对表达水平。 结果： 1.姜黄素对HDACl表达的影响：姜黄素能显著下调Raji细胞HDACl的蛋白表达水平，低浓度和高浓度姜黄素处理组的HDACl蛋白相对定量(HDACl／GrAPDH)分别低于同时间点的未处理组。方差分析的结果表明，差异具有统计学意义(交互作用：F=12.0，P＜0.001；两两比较：P均＜0.0001)，可以推断姜黄素能够抑制Raji细胞HDACl的蛋白表达。 2.姜黄素对HDAC6表达的影响：姜黄素也能显著下调Raji细胞HDAC6的蛋白表达水平，低浓度和高浓度姜黄素处理组的}Tdac6蛋白相对定量(HDAC6／GAPDH)分别低于同时间点的未处理组。方差分析的结果表明，差异具有统计学意义(交互作用：F=17.047，P＜0.001；两两比较：胸＜0.0001)，可以推断姜黄素处理后，Raji细胞HDAC6的蛋白表达水平下降。 结论：姜黄素下调Ⅰ类HDAC—HDACl的同时，也可下调Ⅱ类HDAC—HDAC6提示它是一个潜在的广效HDACl。 第三章:姜黄素对Raji细胞HSP90乙酰化的作用及机制研究研究 目的：研究姜黄素作为一种广效的HDACi抑制剂，对Hsp90的蛋白表达及乙酰化水平的影响，并探讨其可能的机制。 材料与方法： 细胞培养与分组Raji培养于含20％的胎牛血清1640培养基，细胞分2组：空白对照组和25μmol.L-1姜黄素处理组，以空白对照组为阴性对照组。 免疫沉淀：分别在姜黄素作用12、24、36小时后，提取总蛋白，孵育Hsp90抗体后用ProteinA十G Agarose从总蛋白中沉淀Hsp90。 Western b1ot分析分别在姜黄素作用12、24、36小时后，检测各组细胞Hsp90蛋白相对表达水平、Hsp90的乙酰化水平，以及与Hsp90免疫共沉淀的HDAC6蛋白相对水平。 结果： 1.姜黄素对Hsp90蛋白表达水平及乙酰化水平影响25μmol·L-1姜黄素处理组Hsp90的相对蛋白定量与对照组相比，方差分析结果显示差异无统计学意义(F=3.336，P=0.088)，提示本实验姜黄素对Raji细胞Hsp90的蛋白表达水平无明显影响作用。然而，25μmol·L-1-1姜黄素处理组在24、36小时两个时间点的Hsp90相对乙酰化水平分别高于同时间点未处理组，方差分析结果显差异具有统计学意义(交互作用：F=12.007，P=-0.04；两两比较：P均＜0.0001)。可以推测姜黄素不影响Hsp90的蛋白表达，但能够增强Hsp90乙酰化，在蛋白质翻译后水平即乙酰化修饰层面作用于Hsp90。 2.姜黄素对与Hsp90免疫共沉淀的HDAC6影响HDAC6能够与Hsp90免疫共沉淀，提示HDAC6与Hsp90互相结合。24小时、36小时的25μmol·L-1的姜黄素处理组与Hsp90免疫共沉淀的HDAC6相对蛋白含量明显低于同时间点的对照组，方差分析结果显示处理组与对照组的差异有统计学意义(交互作用：F=45.942，P＜0.001；两两比较：P均＜0.0001)，可以推测姜黄素作用于Raji细胞24小时后能够下调与Hsp90结合的HDAC6蛋白水平，并与其对Hsp90乙酰化的作用同步。 结论：姜黄素能够增强Hsp90乙酰化，其机制可能是通过调控Ⅱ类HDAC即HDAC6对其下游分子Hsp90的去乙酰化作用。