胚胎干细胞（ES细胞）是从附置前胚胎内细胞团或原始生殖细胞（PGCs）经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系。因为ES细胞具有分化为各种神经细胞的能力，并能通过核移植方法建立ES细胞系和基因改造两条途径避免移植治疗带来的免疫排斥反应，所以目前被视为神经移植材料的理想来源和基因治疗的理想载体细胞。 阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease，AD）是与中老年人记忆过早丧失有关的神经变性疾病，AD的病理特征是在大脑皮层和海马区域出现β淀粉样蛋白（amyloidβ，Aβ）沉积形成的老年斑，以及神经元的缺失。目前广泛认为Aβ沉积是导致AD的主要因素。松果体分泌的激素——褪黑素（melatonin，MT）水平降低与AD发病有关，MT能通过多条途径抑制Aβ的神经毒性，大量资料显示MT对AD的治疗效果，但是MT在生物体内半衰期极短（外源性MT在血清中的半衰期仅为0.5到5.6秒），有必要考虑其它的给药方式。本实验将合成MT的限速酶基因——AANAT转入ES细胞中，一方面利用MT抗Aβ沉积和抗氧化作用，以阻断AD的致病环节；另一方面利用ES细胞来源的神经前体细胞对AD缺失神经元的替代作用，希望能用于AD的治疗。目前国内外尚未见基因工程化ES细胞用于AD治疗的相关研究。 ES细胞直接移植到脑内，虽然能受环境信号的影响进行分化和整合，但直接移植有形成畸胎瘤的危险。与ES细胞和成熟神经细胞相比，神经前体细胞更适合于移植治疗。因此本实验第一部分探讨了ES培养方法和获得高纯度神经前体细胞的方法。由于缺乏能造成Aβ过度分泌和沉积的动物模型，阻碍了研究AANAT基因工程化ES细胞对AD的疗效，因此本实验第二部分建立了A6过度分泌的细胞模型。在第三部分中我们观察了AANAT基因工程化ES细胞条件培养液以及褪黑素对此细胞模型的影响。 将AANAT基因工程化的ES细胞体外分化为神经前体细胞，并移植到AD动物模型脑中，研究其治疗效果是我们今后要做的工作。 第一部分 进行ES细胞研究的前提和基础是ES细胞的培养。ES细胞体外培养的关键是既要保持细胞快速分裂增殖，又要维持其未分化状态。常用的方法是用原代培养的小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）作饲养层，同时在培养液中添加白血病抑制因子＊eukemia inhibitory factoT3LIF）以维持ES细胞的增殖和未分化状态。由于原代培养MEF工作烦琐而且容易带来污染，我们在实验中应用一种新的饲养层——人胚胎成纤维细胞，观察其对小鼠ES细胞（MESPU13）生长的影响。结果发现采用人胚胎成纤维细胞培养小鼠ES细胞，其碱性磷酸酶染色为阳性，说明能够保持ES细胞的未分化特性。与以往的饲养层相比，这种饲养层的优点是：使用简便，避免污染，有利于支持ES细胞的转基因操作。 在ES细胞诱导为神经细胞的研究中，较早采用也研究较多的是用全反式维甲酸Oetinoic acid，RA）诱导，但是由RA诱导得到的是神经元和神经胶质细胞，得不到正常神经发育过程中所具有的神经前体细胞（neuralprec。s盯 Cdls，NPC），另一途径是1996年Oh劝e提出的无血清培养法。无血清的培养可获得较高纯度的NPC。NPC是较好的神经移植材料。国外已将无血清培养获得的NPC用于移植研究，但是在国内还未见应用无血清培养法由ES细胞培养神经前体细胞的报道，本实验采用无血清培养法获得86％的 NPC，经巢蛋白免疫组化和 RTFCR鉴定为阳性。在实验过程中比较了三种胚胎体的培养方法，以细菌培养皿结合液体培养基的方法简单易行，并可一次获得大量的胚胎体。在胚胎体的贴壁方式上比较了以胚胎体直接贴壁和消化成单细胞贴壁，发现前者存活的神经前体细胞比后者多。在无血清培养液成分上，比较了 ITSF和 NZ，发现两者都能使神经前体细 Vlll 胞选择性生长，在NZ成分中添加纤维连接蛋白，能使存活的神经前体细 胞数量增多。 第二部分 目前采用的AD动物模型分为以下几类：（）神经元直接损伤模型； Q）胆碱能系统功能损伤模型：门）转基因动物模型。前两种动物模型只 能模拟AD后期神经细胞坏死和行为改变，没有AD特征性的病理改变一 一AS沉积，转基因动物模型在复制脑内A6沉积方面效果不稳定，目前国 内尚缺乏能造成AD沉积的稳定动物模型。因此，本实验建立了AD过量 表达的细胞模型。利用分子生物学技术构建瑞典突变型APP695和绿色荧 光蛋白共表达载体。采用脂质体转染的方法，将其转染PC12和CHG＊细 胞。激光共聚焦显微镜下比较各克隆的荧光强度，选择荧光强度高的 PC 和 CHG6细胞各一株，进行投射电镜观察、流式细胞仪检测以及放兔测定 培养液中AS浓度，结果发现：瑞典突变型APP转染能使PC12细胞形态 增大变长，微绒毛增多，分泌A6增多，细胞周