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猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)引起的猪细小病毒病是猪的一种繁殖障碍性传染病,其临床症状主要为妊娠母猪流产,初产母猪产畸形胎、木乃伊胎、死胎等。PPV可在猪的多种传代细胞如猪睾丸(swine testicle,ST)细胞、猪肾(porcine kidney-15,PK-15)细胞等中增殖,并引起明显的细胞病变,但引起细胞病变效应的分子机理尚不明确。本研究以ST细胞为主要研究对象,首先检测PPV感染ST细胞后细胞凋亡相关指标,明确细胞发生了凋亡,然后对PPV诱导的细胞凋亡通路及活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)在细胞凋亡中的作用进行初步探索。研究得到如下结果。1.PPV感染对ST细胞凋亡的影响利用不同滴度的PPV感染ST细胞,检测PPV感染不同时间后的细胞活性,结果表明,PPV感染可抑制ST细胞活性,且呈现感染时间和感染剂量的依赖性;利用AO/EB双染法检测PPV感染后细胞形态学的变化,结果表明,PPV感染ST细胞后,细胞出现核内染色质固缩、细胞核皱缩和碎裂;琼脂糖凝胶电泳结果显示,1.0个病毒感染复数(1.0 multiplicity of infection,1.0 MOI)的PPV感染ST细胞48 h后,细胞内的染色体DNA电泳出现明显的梯状条带;利用流式细胞术检测PPV感染对ST细胞凋亡率的影响,结果显示,ST细胞的凋亡率随着病毒感染时间的延长而逐渐升高。2.PPV感染对细胞凋亡相关蛋白表达的影响Caspase活性检测发现,PPV感染ST细胞能够显著激活细胞内Caspase-9及Caspase-3,而Caspase-8的活性无显著变化,结果表明,PPV可通过Caspase-9/-3级联活化来诱导ST细胞发生凋亡。Western blot检测结果显示,PPV感染对ST细胞内Fas和FasL的表达量无显著影响,但PPV感染能够上调细胞内促凋亡分子Bax的表达,下调细胞内的抑凋亡分子Bcl-2的表达,促进细胞浆中的Bax转位到线粒体中及线粒体内的细胞色素c(Cytochrome c,Cyt c)释放到细胞浆中,进而导致了Caspase-3的底物PARP的切割。流式细胞仪检测显示,随着Bax的转位,线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψm)发生去极化的细胞比率逐渐增加。3.ROS在PPV感染诱导的ST细胞凋亡中的调控作用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测结果表明,PPV感染ST细胞能够引起细胞内ROS的积累。用抗氧化剂PDTC和NAC处理ST细胞,结果显示,PDTC和NAC能够抑制PPV感染引起的ROS积累,降低线粒体膜电位去极化的细胞比率,阻碍Bcl-2表达量的下调,Bax的转位以及Cyt c的释放,下调细胞胞内Caspase-3的活性和细胞凋亡率。本研究表明了PPV可以诱导ST细胞发生凋亡,阐明了PPV诱导的细胞凋亡是通过线粒体信号转导通路实施的,初步探索了ROS在PPV诱导ST细胞发生凋亡过程中的作用及机制,为进一步探索PPV感染对宿主细胞的致病机制提供理论依据,同时也为研究其它猪病病毒的致病机制提供新思路。