目的：近年来，在探讨肝癌的发病机制、早期诊断的方法和有效的治疗方案中，采用动物模拟人类肝癌，观察其免疫疗法、靶向治疗及早期诊断等新方法、新手段的应用效果。为此，建立一个稳定的、符合实验要求的肝癌模型是很有必要的。目前，建立动物模型的方法很多，有自发、诱发、移植、转基因的动物模型。可在肝癌的实验研究中，化学药物诱发肝癌动物模型较常用，多以二乙基亚硝胺（DEN）化学药物作为诱导剂，因二乙基亚硝胺(DEN)对肝脏有明显的亲和力，可导致人和动物中毒和致癌的双重作用[18]。但由于诱导方法和剂量的关系，造模的特点和效果不同。而且，肝癌的发生是启动、促进和进展的一个复杂过程，是多因素、多阶段的病理进程。因此，造模很难达到理想得目的和实验要求。为此，我们采用二乙基亚硝胺（DEN），以不同方法、剂量诱发大鼠肝癌，①优化和筛选二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌的方法和剂量。②观察二乙基亚硝胺(DEN)对大鼠血清甲胎蛋白（AFP、AFP-L3）和凝血酶原（APT）含量的影响；③观察二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌组织的病理学改变的特点；通过观察大鼠肝癌形成的全过程，进行综合的分析和评价，优化和筛选出最佳的注射方法和剂量，为我们课题组开展基因（FL)导入大鼠肝癌的肝脏，进行免疫治疗的实验研究，提供一个可行的造模方法。同时，为探讨肝癌的致病机制、早期的诊断提供一个稳定、可靠的肝癌模型。方法：取约6周龄、体重150g±10、近交系的、健康的雄性大鼠（Wistar）90只，饲养1周，以适应新环境。将大鼠随机分组，分为正常对照组（A-B、A-C和A-D组）每组6只，共18只；给药组：采用3种方法、4个剂量，以腹腔注射法（B组）、尾静脉注射法（C组）和灌胃法（D组），每组的4个剂量：12.5mg/Kg为B1-D1、25.0mg/Kg为B2-D2、50.0mg/Kg为B3-D3、75.0mg/Kg为B4-D4，每剂量6只，共72只。第2-7周给药品二乙基亚硝胺，每周注射2次，第8周停药，观察到16周。正常对照组给予生理盐水，0.2ml/只/次；二乙基亚硝胺(DEN)4个剂量。每个组、每只大鼠的体重，注射前称一次，注射后每周称一次，并记录。腹腔注射法：用75%的酒精棉球消毒每只大鼠的下腹部，用1ml的注射器抽取生理盐水(0.2ml/只/次)和4个剂量的二乙基亚硝胺(B1为12.5mg/Kg/只/次、B2为25.0mg/Kg/只/次、B3为50.0mg/Kg/只/次、B4为75.0mg/Kg/只/次)，分别注入大鼠的腹腔。正常A-B组注射6只，给药B组的每个剂量6只，共30只。尾静脉注射法：用75%的酒精棉球消毒每只大鼠的尾部，用1ml注射器抽取生理盐水(0.2ml/只/次)和4个剂量的二乙基亚硝胺(C1为12.5mg/Kg/只/次、C2为25.0mg/Kg/只/次、C3为50.0mg/Kg/只/次、C4为75.0mg/Kg/只/次)，分别注射大鼠的尾静脉。生理盐水注射6只，每个剂量6只，共30只。灌胃法：用1ml的注射器和特制的灌胃针头抽取生理盐水(0.2ml/只/次)和4个剂量的二乙基亚硝胺(D1为12.5mg/Kg/只/次、D2为25.0mg/Kg/只/次、D3为50.0mg/Kg/只/次、D4为75.0mg/Kg/只/次)，分别经口灌入大鼠胃里。生理盐水注射6只，每个剂量6只，共30只。每天观察、记录大鼠的进食量、饮水量，有无竖毛、怠动、厌食、弓背等毒性反应，存活情况；计算每组和每个剂量大鼠的存活率，比较给药的方法和剂量。第16周，用水合氯醛逐个麻醉大鼠，剖腹、暴露腹主动脉，用10ml的注射器抽取动脉血，静置、离心(3000转/分，10分钟)，吸取血清，采用上海源叶化学试剂公司的酶联免疫吸附试验试剂盒(ELISA)，按说明书的操作步骤，检测甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)和异常凝血酶原(APT)的含量。用酶标仪在450nm波长下测定OD值，绘制标准品的线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。根据各组和各剂量的浓度值观察二乙基亚硝胺对大鼠血清中甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)和异常凝血酶原(APT)含量的变化，分析是否与大鼠肝组织的病理变化有关。将取完血清的大鼠剖腹，首先用肉眼观察各脏器及肝组织的颜色，有无充血、水肿、硬化、癌结节；如肝上有结节，摘除结节，用游标卡尺测量、计录结节的大小。将摘除的结节放10%的甲醛固定，石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色，用酒精逐级脱水，封片。光学显微镜下观察各组及各剂量大鼠肝组织的病变程度。分析大鼠肝组织的病理学改变是否与诱癌药二乙基亚硝胺的毒性有关。结果：1.二乙基亚硝胺(DEN)对大鼠的毒性反应：①大鼠16周体重的变化：正常对照组大鼠的体重：10周前，随着饲养周数的递增，体重持续增长，增长波很明显；10周后体重相对恒定（成年鼠），波峰平缓增长。体重平均由150g±增至400克±／只；给药（二乙基亚硝胺）组：其腹腔注射与尾静脉注射及灌胃3种方法的体重无明显的区别，而在不同方法、相同剂量中：12.5mg/kg剂量大鼠的体重，增长波明显（1-10周），但波峰低于正常对照组。体重平均由150g±增至360克±／只；25mg/kg剂量大鼠体重的增长波缓慢上升（1-10周前），10周后体重增长不明显，体重平均由150g±增至340克±／只。50mg/kg剂量大鼠体重的波峰不明显（1-10周），体重均由150g±增至300克±／只；在14-16周，体重均下降为280克±／只。75mg/kg剂量大鼠体重的波峰较平坦（1-10周），体重平均由150g±增至260克±／只；在12-16周，体重均下降为240克±／只。说明注射的方法对大鼠的代谢和吸收有一定的影响，但无明显的区别；而大鼠的体重是随着药物剂量的增大，毒性增强，导致体重下降。②二乙基亚硝胺(DEN)对大鼠存活的影响：在16周的观察中，正常组大鼠的采食量、饮水量、活动量、体毛等各项指标无明显改变，无死亡的现象，存活率均为100%。其腹腔注射法：50mgkg、75mgkg剂量（B3、B4）大鼠有5只出现食量、饮水量减少，毛疏松、竖毛、怠动、厌食、弓背，于第13、14周死亡，存活率为79.17%；尾静脉注射的25、50、75mgkg剂量大鼠有7只出现以上毒性反应，于第10-14周死亡，存活率为70.83%；灌胃的25、50、75mgkg剂量大鼠有10只出现以上毒性反应，于第7-14周相继死亡，存活率为58.33%，腹腔注射法的存活率高于尾静脉注射和灌胃组，说明腹腔注射法优于尾静脉注射和灌胃法。3种方法大鼠的总存活率为69.44%；在4个剂量中：12.5mgkg剂量大鼠的毒性反应不明显，存活率为100%；25.0mgkg剂量的毒性反应弱，存活率为83.33%；50.0mgkg剂量的毒性反应明显，存活率为66.67%；75.0mgkg剂量的毒性反应大，存活率仅为27.78%；其大鼠的存活率均随着饲养周数的递增、药物的储留，其毒性反应明显，存活率逐日降低。75.0mgkg剂量的毒性大，存活率均＜50%，不能作为诱癌的剂量。2.观察二乙基亚硝胺(DEN)对大鼠血清甲胎蛋白（AFP、AFP-L3）和凝血酶原（APT）含量的影响；①甲胎蛋白(AFP)的含量随着二乙基亚硝胺剂量的增加，血清的含量增高，均高于正常对照组（表7）；在4个剂量间比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。说明甲胎蛋白(AFP)的含量与肝组织病变有关。②甲胎蛋白异质体(AFP-L3)，25mg/kg、50mg/kg和75mg/kg剂量的AFP-L3含量均高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)。尤其75.0mg/kg剂量血清AFP-L3的浓度明显增高。说明AFP-L3可判断肝组织的损伤程度（表8）。③异常凝血酶原(APT)的血清浓度，12.5mg/kg剂量与正常组无差异(P>0.05)；25.0mg/kg、50.0mg/kg和75.0mg/kg剂量APT的含量明显高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.01)。说明随着肝组织病变程度的加重，异常凝血酶原的含量可增高（见表9）。3.二乙基亚硝胺(DEN)对大鼠肝脏的影响：用肉眼观察大鼠的肝脏，正常组大鼠的肝脏表面光滑，质地柔软，颜色为鲜红色(图3)；12.5mg/kg剂量大鼠肝脏的颜色变为红色，肝有肿大的现象(图4)；25.0mg/kg剂量大鼠肝脏的颜色变为深红色，质地硬(图5)；50.0mg/kg剂量大鼠的肝缩小，颜色为暗红色，表面粗糙、质地硬，肝上出现散在的、大小不等的、灰白色的癌结节（0.5～1.5cm），但未见腹水及转移性瘤(图6)；75.0mg/kg剂量大鼠的肝脏为紫红色或棕黄色，质地硬，包膜破坏，有突出肝表面的癌包块，并与周围器官粘连，包块的直径1.3～2.4cm×1.8～2.8cm，(图7)。在4个剂量比较中，随着给药剂量的加大，肝组织的病变加重。病变的发展是否与人类肝癌病变的特点相似，应进一步做肝组织病理切片，证实二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝组织病变的程度是否与诱癌剂量有关。光镜下，正常组（A组）大鼠肝脏，肝小叶内肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞大小一致，胞质丰富(图8)。12.5mg/kg剂量组显示肝炎的病理改变：肝小叶内弥漫性的肝细胞空泡变性，部分区域可见灶状及大片状肝细胞坏死；坏死区及汇管区可见炎细胞浸润(图9)。25.0mg/kg剂量组显示典型的肝硬化的病理改变：肝脏正常肝小叶结构破坏，被大小不等、形状不规则的假小叶取代，假小叶内肝细胞排列紊乱，肝细胞有变性、坏死，小叶周边区可见再生的肝细胞，细胞体积较大，双核或多核(图10-11)。50.0mg/kg剂量组大鼠肝脏显示出肝癌的病理改变：癌细胞排列成大小不等的实性细胞团，部分区域出现坏死；癌细胞有明显的异型性。(图12-13)。在75.0mg/kg剂量组细胞异型性更加明显，核分裂像多见，可见病理性核分裂像(图14-15)。说明随着二乙基亚硝胺(DEN)剂量的增大，肝组织病变程度加重。以上实验证实二乙基亚硝胺(DEN)有双重作用：既引起大鼠中毒的现象，又导致大鼠肝癌的形成。其肝癌的形成、病变的发展过程与人肝癌自然形成相似，经历了肝炎、肝硬化和肝癌的病变期。结论1、以50.0mg/kg的二乙基亚硝胺(DEN)腹腔注射为最佳剂量和方法，成功率高，操作简便、诱癌时间短、经济，可作为研究人类肝癌诊断和治疗的一种理想动物模型。2、灌胃对食道易损伤，影响动物的摄食、消化和吸收，诱癌成功率较低，不可取。3、尾静脉注射对鼠尾的皮肤、血管易造成损伤，影响药物的注射，不易操作。4、二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌血清的肿瘤标记物甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)和异常凝血酶原(APT)含量的变化与大鼠病变程度呈正相关，检测结果与临床诊断的指标相符，三者联合可提高肝癌早期诊断率。5、二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的毒性反应和肝脏损伤程度与人肝癌自然发病的过程相似，此药对肝有明显的亲和力，16周可见癌细胞的形成，诱癌率高、较专一，缩短了以往资料的建模时间，节省人力、物力和财力，是诱发肝癌和致癌性强的化学药物。