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在长久以来的进化中,植物发展出一系列对病毒的免疫机制,其中包括：R基因介导的抗病毒机制,RNA沉默(RN A silencing),凝集素蛋白介导的抗病毒机制和其他一些寄主蛋白如一些翻译起始因子和内质网蛋白等；另一方面,植物病毒为能成功侵染植物,或通过突变、重组等使自身进化,或通过编码蛋白如RNA沉默抑制子来抵抗植物的免疫防卫反应。本文分别从这两方面阐述植物与病毒互作机理：一方面以苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)病毒为研究对象阐述病毒抵抗寄主植物的免疫反应机理,另一方面以烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)和模式植物拟南芥互作系统为研究对象,探索植物对病毒的免疫反应机理。分别取得了如下研究结果：1.源于梨的ASPV分子变异及遗传进化分析为了明确我国梨树上ASPV群体结构以及分子进化机制,本研究从国内不同的的梨产区采集总共451份梨树样品进行ASPV检测,共检测到145份ASPV阳性样品,克隆部分阳性样品完整CP(31份),TGB(44份)和部分RdRp片段(P1和P2)(3份)。其中测序了来源于31个分离物的169个CP克隆,44个分离物的95个TGB克隆,RdRp的部分片段P1和P2分别测序了来源于3个分离物的17和14个克隆。分别基于本研究测序的这三个基因序列以及GenBank上报道的序列构建进化树,结果表明：1)ASPV在进化树上的分组与寄主(苹果,梨和来自中国新疆的库尔勒香梨)存在相关性；2)来源于梨分离物的ASPV CP序列在进化树被上分为6个亚组(A-F),其中B和F亚组序列在本研究中首次报道；3)本研究首次系统研究ASPV TGB基因序列,在进化树上将其分为5个小组。序列多重比对结果表明源于梨分离物的ASPV CP和RdRP序列存在连续的核苷酸插入或者缺失。重组分析结果表明本研究测序的完整CP, TGB和部分RdRp片段(P2)中均检测到重组事件。选择压力分析结果表明ASPV CP和TGB在自然进化过程中被负向压力选择(Negative Selection)。以上结果表明碱基突变(插入或者缺失)、重组和负向选择压力是我国ASPV群体结构多样性的主要原因。2. ASPV沙梨分离物HB-HN1全长和vsiRNA特性分析本研究扩增了湖北省某果园的沙梨(二十世纪)样品的ASPV基因组全长(9270nt,除去polyA尾),命名为HB-HN1。 HB-HN1与已经报道的11个ASPV分离物的全长核苷酸序列相似性在72.4%-80.0%之间。将12个ASPV全长的5个基因序列分别进行比对,发现不同的基因比对结果与全长的相似性存在差异。ASPV基因组的5’端非翻译区相对保守而3’端非翻译区则变异相对较大。基于这12个ASPV分离物全长核苷酸序列构建系统进化树,结果表明：ASPV在进化树上的分组与寄主有关。分析ASPV-vsiRNAs的结果表明ASPV正负链RNAs在生成vsiRNAs时贡献相当(分别是59.1%和40.9%),而且这些vsiRNAs几乎平均分布在ASPV整个基因组。ASPV-vsiRNAs5’端碱基偏向性分析结果发现,除了常见的5’端A和U偏向性,本研究中出现vsiRNAs 5’端C的偏向性的几率也很大。3.源于不同分离物的ASPV编码蛋白功能多样性分析本研究构建了ASPV CP 5个梨分离物(HB-HN1-3、HB-HN7-18、HB-HN6-8、 HB-HN9-3、YN-MRS-17)和1个苹果分离物(LN-AP-1)的原核表达载体,在大肠杆菌中特定条件下(30℃,含50mg/L Kan, 1mM/L IPTG的LB培养基中诱导表达6h)可以高效的表达ASPV不同分离物重组外壳蛋白。重组CP经纯化后免疫大耳白兔,制备了ASPV 3个不同分离物的多克隆抗血清,分别命名为PAb-HB-HN9-3, PAb-HB-HN6-8和PAb-YN-MRS-17。Western-blot结果表明本研究制备的3个不同抗血清在检测ASPV不同分离物(HB-HNl-3、HB-HN7-18、HB-HN6-8、HB-HN9-3、 YN-MRS-17和LN-AP-1)原核表达蛋白时反应强度存在明显差异。RNA沉默抑制子鉴定的结果表明ASPV CP具有抑制RNA沉默功能。利用PVX病毒载体表达ASPV CP (PVX-ASPV-CP),将构建好的重组载体转入农杆菌后,农杆菌浸润接种接种西方烟,发现相比PVX (wt), PVX-ASPV-CP能够在西方烟上引起严重的症状。本研究通过分析ASPV不同分离物CP沉默抑制功能以及在西方烟上的致病性,发现不同分离物CP分子变异并不影响CP抑制RNA沉默功能及其在西方烟上的致病性。然而,ASPV TGB3不同分离物分子变异却影响了其编码蛋白跨膜区域。4.RNA沉默和P-bodies相关组分在病毒Recovery以及VIGS过程中扮演的作用RNA沉默是植物主要的抗病毒机制之一。病毒诱导的RNA沉默的原理就是植物体内的Dicer-like酶识别病毒的dsRNA并将其切割成siRNA,随后这些siRNA与AGO蛋白家族结合并引导这些蛋白靶标目标同源RNA。在植物病毒研究领域,一方面RNA沉默的机制很长一段时间解释了病毒的Recovery现象,认为植物通过RNA沉默机制沉默了病毒RNAs导致植物从病毒引起的症状中Recovery;另外一方面病毒诱导的RNA沉默用来沉默植物的内源基因(virus-induced gene silencing, VIGS)。虽然Recovery和VIGS的机理被认为基于RNA沉默,但是引起这两种现象的真正机理尚不清楚。本研究采用目前应用非常广泛的烟草脆裂病毒沉默载体(Tobacco rattle virus, TRV)作为研究工具,为达到研究的目的,将拟南芥内源基因八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)口外源基因绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein, GFP)插入该病毒载体,分别作为VIGS以及Recovery的研究工具。研究结果显示AG02和AG04在拟南芥中起到抵抗TRV的作用而AGO1却参与病毒介导的内源基因的沉默。然而所有接种TRV-GFP的拟南芥AGO基因的突变体植株最终都Recovery,说明病毒引起的Recovery现象可能是由不同的机制介导的。提取核糖体RNAs的结果显示Recovery的植株中病毒RNA翻译效率降低,而这些没有翻译的病毒RNA可能进入细胞内P-bodies。