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目的：
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤，约占口腔癌的90%。不仅危及患者生命，还影响美观和生存质量。尽管近年来采用手术、放疗、化疗及靶向治疗等综合治疗方法，但OSCC的5年生存率仍在50%左右。因此，需要寻找新的治疗方法和治疗靶点，以提高OSCC的疗效。
OSCC的发生发展是多种基因相互作用的结果，涉及癌基因的激活和抑癌基因的功能失调，细胞能量代谢信号通路和细胞分化信号通路的异常，以及细胞外环境改变促进肿瘤细胞侵袭转移和免疫逃逸等因素。蛋白质作为基因的编码产物和生物体信号传递的重要载体，其种类和水平的表达异常在肿瘤发生发展中发挥重要作用。近年来蛋白组学(Proteomics)和质谱法(MassSpectrometry,MS)的发展为研究肿瘤中蛋白的作用提供了条件，研究OSCC中关键蛋白的功能及其互作蛋白网络有助于阐明OSCC发生发展的分子机制，为OSCC的诊断、治疗和预后判断提供帮助。
我们课题组前期研究证实成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation proteinalpha，FAP)在OSCC的肿瘤细胞外基质及肿瘤细胞内高表达，并与临床分期及淋巴结转移等密切相关，是独立的预后因子。进一步实验证实，FAP能促进OSCC细胞生长、侵袭和转移；抑制FAP表达，能通过Akt/PI3K信号通路明显抑制口腔鳞癌细胞生长、侵袭和转移。但是FAP在OSCC中确切的作用机制尚不清楚需要进一步的研究。
本研究拟在前期研究的基础上，利用免疫共沉淀和质谱结合的方法筛选FAP的互作蛋白，为并候选互作蛋白进行初步互作验证和功能做初步探究，以阐明FAP影响OSCC发生发展的确切的分子机制，为靶向治疗OSCC提供新的思路。
方法：
1．FAP真核表达载体的构建和稳定细胞株的建立
利用基因重组技术，将通过逆转录得到的FAP野生型全长插入到pCDH-CMV-MCS-EFI-copGFP载体中。将重组病毒表达载体(pCDH-FAP)和辅助载体(psPAX2，pMD2.G)共转染工具细胞，收集上清液后感染口腔鳞癌细胞。通过流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting，FACS)筛选阳性细胞，得到稳定过表达FAP的口腔鳞癌细胞。
2．免疫共沉淀联合质谱筛选FAP互作蛋白以及数据库分析候选蛋白
提取稳定过表达FAP的口腔鳞癌细胞总蛋白，免疫共沉淀技术以及质谱分析，得到与FAP可能的互作蛋白。根据对质谱结果，利用GO，String等数据库进行生物信息学分析，分析得到FAP互作候选蛋自进行进一步互作验证。
3．互作蛋白DPP9初步验证以及初步功能探讨
利用标签抗体和免疫共沉淀磁珠进行免疫共沉淀反应，验证候选蛋白DPP9与FAP的物理互作效应。采用荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫组化的方法检测OSCC标本和配对的癌旁组织中DPP9的表达情况，以探讨DPP9在mRNA和蛋白水平的表达情况。采用siRNA特异性干扰SCC9中DPP9的表达，qRT-PCR和蛋白质印记(Western Blot，WB)验证干扰效率后，分别利用CCK8检测干扰后细胞活性变化，Transwell分析细胞转移和侵袭的能力变化，以探讨抑制DPP9表达对OSCC细胞生长、侵袭、转移的影响。
结果：
1．过表达FAP的稳定细胞株的构建成功
在荧光显微镜下可见绿色荧光表达，流式细胞仪显示绿色荧光阳性率为91.44%，qRT-PCR和Western Blot显示与空白对照组相比，FAP在mRNA和蛋白水平均为高表达。
2．免疫共沉淀联合质谱筛选FAP互作蛋白以及数据库分析候选蛋白
提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝染色证实免疫共沉淀筛选出内源性FAP互作蛋白。将总蛋白酶解后抽提酶解肽段进行ESI质谱，利用软件分析质谱结果鉴定互作蛋白种类，两次独立实验得到相同的24种与FAP可能存在互作关系的蛋白，其中6种蛋白与FAP有相同的GO功能注释，13种蛋白与FAP有共同的亚细胞定位，1种蛋白有相似的结构域。DPP9作为与FAP有共同的细胞定位，相同的GO注释以及类似结构域的蛋白，被选为我们进一步研究的目标蛋白。
3．DPP9为FAP互作蛋白，且OSCC中DPP9的表达下降，抑制DPP9会改变SCC9细胞多种功能
利用标签抗体和免疫共沉淀磁珠进行免疫共沉淀反应，与IgG对照组相比，在总蛋白裂解液和IP洗脱液中均检测到FAP标签HIS蛋白和DPP9，证实DPP9是FAP的互作蛋白。免疫组化和qRT-PCR结果显示,DPP9在OSCC中表达量低于配对口腔黏膜组织；siRNA抑制SCC9中DPP9的表达，能增强SCC9细胞活性，促进细胞迁移、侵袭。
结论：
1．成功构建重组病毒真核表达载体pCDH-FAP以及稳定过表达FAP的OSCC细胞株；
2．通过两次独立的实验获得FAP互作蛋白24个，生物信息学分析后得到，其中与FAP参与共同的生物过程的蛋白有6个，与FAP具有相同结构域的蛋白有1个，与FAP具有相同细胞定位的蛋白有13个;
3．DPP9蛋白与FAP在OSCC细胞中存在相互作用，DPP9在OSCC中表达低于配对正常黏膜组织，且抑制DPP9可以增强OSCC细胞株SCC9的细胞活性，促进其侵袭和转移。
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤，约占口腔癌的90%。不仅危及患者生命，还影响美观和生存质量。尽管近年来采用手术、放疗、化疗及靶向治疗等综合治疗方法，但OSCC的5年生存率仍在50%左右。因此，需要寻找新的治疗方法和治疗靶点，以提高OSCC的疗效。
OSCC的发生发展是多种基因相互作用的结果，涉及癌基因的激活和抑癌基因的功能失调，细胞能量代谢信号通路和细胞分化信号通路的异常，以及细胞外环境改变促进肿瘤细胞侵袭转移和免疫逃逸等因素。蛋白质作为基因的编码产物和生物体信号传递的重要载体，其种类和水平的表达异常在肿瘤发生发展中发挥重要作用。近年来蛋白组学(Proteomics)和质谱法(MassSpectrometry,MS)的发展为研究肿瘤中蛋白的作用提供了条件，研究OSCC中关键蛋白的功能及其互作蛋白网络有助于阐明OSCC发生发展的分子机制，为OSCC的诊断、治疗和预后判断提供帮助。
我们课题组前期研究证实成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation proteinalpha，FAP)在OSCC的肿瘤细胞外基质及肿瘤细胞内高表达，并与临床分期及淋巴结转移等密切相关，是独立的预后因子。进一步实验证实，FAP能促进OSCC细胞生长、侵袭和转移；抑制FAP表达，能通过Akt/PI3K信号通路明显抑制口腔鳞癌细胞生长、侵袭和转移。但是FAP在OSCC中确切的作用机制尚不清楚需要进一步的研究。
本研究拟在前期研究的基础上，利用免疫共沉淀和质谱结合的方法筛选FAP的互作蛋白，为并候选互作蛋白进行初步互作验证和功能做初步探究，以阐明FAP影响OSCC发生发展的确切的分子机制，为靶向治疗OSCC提供新的思路。
方法：
1．FAP真核表达载体的构建和稳定细胞株的建立
利用基因重组技术，将通过逆转录得到的FAP野生型全长插入到pCDH-CMV-MCS-EFI-copGFP载体中。将重组病毒表达载体(pCDH-FAP)和辅助载体(psPAX2，pMD2.G)共转染工具细胞，收集上清液后感染口腔鳞癌细胞。通过流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting，FACS)筛选阳性细胞，得到稳定过表达FAP的口腔鳞癌细胞。
2．免疫共沉淀联合质谱筛选FAP互作蛋白以及数据库分析候选蛋白
提取稳定过表达FAP的口腔鳞癌细胞总蛋白，免疫共沉淀技术以及质谱分析，得到与FAP可能的互作蛋白。根据对质谱结果，利用GO，String等数据库进行生物信息学分析，分析得到FAP互作候选蛋自进行进一步互作验证。
3．互作蛋白DPP9初步验证以及初步功能探讨
利用标签抗体和免疫共沉淀磁珠进行免疫共沉淀反应，验证候选蛋白DPP9与FAP的物理互作效应。采用荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫组化的方法检测OSCC标本和配对的癌旁组织中DPP9的表达情况，以探讨DPP9在mRNA和蛋白水平的表达情况。采用siRNA特异性干扰SCC9中DPP9的表达，qRT-PCR和蛋白质印记(Western Blot，WB)验证干扰效率后，分别利用CCK8检测干扰后细胞活性变化，Transwell分析细胞转移和侵袭的能力变化，以探讨抑制DPP9表达对OSCC细胞生长、侵袭、转移的影响。
结果：
1．过表达FAP的稳定细胞株的构建成功
在荧光显微镜下可见绿色荧光表达，流式细胞仪显示绿色荧光阳性率为91.44%，qRT-PCR和Western Blot显示与空白对照组相比，FAP在mRNA和蛋白水平均为高表达。
2．免疫共沉淀联合质谱筛选FAP互作蛋白以及数据库分析候选蛋白
提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝染色证实免疫共沉淀筛选出内源性FAP互作蛋白。将总蛋白酶解后抽提酶解肽段进行ESI质谱，利用软件分析质谱结果鉴定互作蛋白种类，两次独立实验得到相同的24种与FAP可能存在互作关系的蛋白，其中6种蛋白与FAP有相同的GO功能注释，13种蛋白与FAP有共同的亚细胞定位，1种蛋白有相似的结构域。DPP9作为与FAP有共同的细胞定位，相同的GO注释以及类似结构域的蛋白，被选为我们进一步研究的目标蛋白。
3．DPP9为FAP互作蛋白，且OSCC中DPP9的表达下降，抑制DPP9会改变SCC9细胞多种功能
利用标签抗体和免疫共沉淀磁珠进行免疫共沉淀反应，与IgG对照组相比，在总蛋白裂解液和IP洗脱液中均检测到FAP标签HIS蛋白和DPP9，证实DPP9是FAP的互作蛋白。免疫组化和qRT-PCR结果显示,DPP9在OSCC中表达量低于配对口腔黏膜组织；siRNA抑制SCC9中DPP9的表达，能增强SCC9细胞活性，促进细胞迁移、侵袭。
结论：
1．成功构建重组病毒真核表达载体pCDH-FAP以及稳定过表达FAP的OSCC细胞株；
2．通过两次独立的实验获得FAP互作蛋白24个，生物信息学分析后得到，其中与FAP参与共同的生物过程的蛋白有6个，与FAP具有相同结构域的蛋白有1个，与FAP具有相同细胞定位的蛋白有13个;
3．DPP9蛋白与FAP在OSCC细胞中存在相互作用，DPP9在OSCC中表达低于配对正常黏膜组织，且抑制DPP9可以增强OSCC细胞株SCC9的细胞活性，促进其侵袭和转移。